葡萄糖参考方法.docx
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葡萄糖参考方法
测定葡萄糖的推荐参考方法
1.样本处理、保存和储藏
a：
在处理任何葡萄糖溶液中最基本的预防措施是防止糖分解。
这种方法设计用于无细胞的样本。
为了更好地保持葡萄糖的最初浓度必须避免微生物和细菌污染，这是样本分解的主要来源，少量样本的蒸发也可能产生严重问题，由于化学污染能在很短时间内产生，因此，在处理和保存样本时严格要求样本瓶清洁、无菌、密闭。
b:
葡萄糖标准溶解稀释在1g/L安息香酸溶液中，可抗微生物污染，它在4℃可长期保存在室温下可稳定数周。
葡萄糖标准的水稀释液或其他稀释液和复溶冻干品对糖分解非常不稳定，须经过无菌或加入防腐剂处理。
c：
用于这个分析的样本所使用的生物样品严格限定为血清和血浆，两种标本在制备与保存中要求特殊的防腐抗细菌学糖酵解以及细胞学伤害。
冻干血清产品不一定分离这些污染物，通常比新鲜收集的阴性血清糖酵解速度快。
血液在无菌条件下收集，即使使用了防腐剂，过期控制与校准品样品也必须进行过滤以除掉组织细胞和微生物，由于细胞糖酵解的完全抑制剂有限，许多这样物质存在干扰问题，因此血浆与血清必须离心确保产生与细胞分离的血清。
血清可以保存到任何时间。
在含有抗凝剂或收集的血清中加入足量防腐剂。
肝素、草酸盐、柠檬酸和EDTA不干扰这项分析。
NaF是安全防腐剂，但是作为高浓度的专用抗凝剂不可避免的产生血浆不稳定并干扰这项分析。
肝素以外的抗凝剂导致血样本中细胞内水和其他物质的渗透压的改变，最终导致血浆葡萄糖浓度的改变。
d.血中NaF在2.0mg/ml浓度是推荐防腐浓度。
NaF最好与1mg/mlEDTA-Na2盐联合使用，这个混合物在常规真空采血管中是可能的（加到收集的血清或血浆中，1mg/mlNaF浓度足够）。
e：
收集的新鲜样本必须立即混匀，轻轻地溶解干的抗凝剂，防止冷冻血浆中Fb的后期问题.
f样本长期储藏的关键是无菌、密闭、低温和远离细胞或化学污染物。
超过48h的保存，即使已经经防腐处理，样本也应在容器中冷冻，确保密闭和防止水蒸气渗入；选择深色小玻璃瓶。
通过特定的合适的螺旋帽可获得一个很好的密封，在小于30℃的水容箱中冰冻样本迅速融化。
在同一瓶反复溶解，样本反复取样，增加样本潜在分解、蒸发和污染的危险。
2.要求和材料说明
a:
量值测量
（1）天平精密度
（2）天平准确度
（3）样本转移（量取）
b:
分光光度计测量
（1）比色杯系统
（a）固定位置
（b）单一杯子
（c）单一1.0cm比色杯
（2）340nm分光光度计特性
（a）光谱溶液、波长和杂散光：
340nm时半波宽≤8nm。
重复测定340nm处波长精密度和准确度在±2nm之间，340nm处杂散光<0.1%，这些影响因素的总和被消除时不降低仪器对超浓度NADH的溶液的线性反应性，NADH溶液吸光度的实验在340nm时，吸光度在正常设定狭缝宽度时为1.0±10%范围内。
适当的空白溶液时在仪器半波宽2倍外时不改变超过±0.5%。
（b）稳定性：
低于噪音，每小时吸光度漂移<0.001Abs，在要求的狭缝和能量水平时，在1.0Abs时，每小时吸光度漂移<0.003Abs。
（c）分光光度计不精密度，包括噪声。
对0.000--1.500Abs范围甚至更宽时，重复读数时的变异率（1SD）<0.0005Abs或任意吸光度读数的0.25%。
（d）分光光度计线性：
在0.100-1.000Abs之间的任何水平，测定吸光度的线性斜率是最好的，通过调零后，应<0.001Abs或小于吸光度的0.5%。
在葡萄糖分析或NADH的精确稀释量的吸光度测量的定标反应曲线的测量中，（分光光度计元件导致的）相应浓度吸光度的变化率的测量误差，与0.2-1.000Abs之间的测定的变异率0.5%没有明显不同，<0.2Abs时，相应影响在均值变化率+0.001Abs
c：
玻璃制品
（1）所有玻璃制品必须化学清洁，清洁程序包括至少用（）冲洗2遍，蒸馏水和在清洁环境中干燥。
（2）
（3）
d：
化学说明书：
（1）试剂水：
（2）无CO2水：
试剂水在敞开的长颈烧瓶中煮沸15分钟，用透明的玻璃瓶盖或用碱石灰帽盖住冷却，直到使用前。
（3）葡萄糖标准：
用国家标物局有证D-葡萄糖标准品：
SRM917配制，葡萄糖标准液的原有尖顶瓶储存于实验室的充满无水硫酸钙的真空干燥容器中。
（4）化学试剂
（a）硫酸锌，7个结晶水，ACS说明书
（b）Ba（OH）2,8H2O,ACS说明书
（c）醋酸Mg,4H2O,ACS说明书
（d）Trisbase，reagentgrade
（e）Tris-HCLreagentgrade
（f）β-NAD+（氧化型），2H2O,纯度>98%，常规称重。
（g）ATP-Na2.3H2O,纯度>98%，常规称重。
（h）牛血清AlB,第五部分，纯度96-99%。
（i）葡萄糖-1-磷酸，二钠盐，4H2O，纯度>98%
（j）D-果糖，NAS/NRC说明书
（k）安息香酸：
见ACS说明书
（5）酶说明：
（a）HK（ATP:
6-磷酸D-葡萄糖转移酶；EC2.7.1.1），酶来源于酵母，要求高纯度，4.d中给出恰当的酶检验数据，注意4.d
（2）.
（b）G6PDH（6-磷酸-D-葡萄糖：
NAD（P）氧化还原酶；EC1.1.1.49），酶来源于肠膜明串珠菌，可以悬浮于硫酸胺液或为冻干粉，要求高纯度，4.d中给出恰当的验证数据，注意4.d
（2）.
3.血清或血浆中葡萄糖测定程序：
a:
原液标准液的配制：
（1）安息香酸稀释液（1g/l）：
在大容量瓶中用2000ml热的试剂水溶解2.0gACS级安息香酸，彻底混匀，盖盖冷却至室温。
全部液体倒进试剂瓶，密闭保存于室温。
（2）葡萄糖标准贮存液（10g/l）：
称取5.000±0.002gNBS无水D-葡萄糖，放入500mlclassA级容量瓶中，用安息香酸稀释液冲洗和稀释葡萄糖至容量瓶的2/3瓶处，旋转使葡萄糖完全溶解，加安息香酸溶液至500ml标记线下1cm处，把容量瓶放20℃±1℃水槽中，水没至瓶颈处，密闭，用安息香酸稀释液补足前平衡溶液30分钟。
塞紧颠倒混匀至少10次，每一次颠倒、旋转倒置容量瓶10秒。
每125ml一份，放入带有螺旋盖的硼硅酸盐的瓶中，盖紧并标记，还要注明日期。
保存在4℃或-20℃。
一瓶用于制备1整套系列标准液。
如果处理得当，准备充分，这种标准原液可以长期稳定，但还是建议每6个月重新配制。
在一个新批号开始使用之前，从新标准原液配一个新的mg/dl（11.10ml/l）工作标准，与旧的系列标准在一批测试各双份比较它们的变异。
（3）葡萄糖工作标准液
（a）配制一套纯品葡萄糖的系列工作标准液：
葡萄糖标准原液和安息香酸稀释液在20℃+1℃的水浴箱中平衡30分钟，按下表转移等份的葡萄糖原液至100mlclassA容量瓶中，用安息香酸稀释液稀释至接近刻度，在水浴箱中平衡15分钟后调至刻度线。
为配制标准需准备一特殊系列的CLASSA级100ml容量瓶和5、10、20ml加样器。
贮存标准（ml）
用安息香酸稀释液稀释的最终体积（ml）
最终葡萄糖浓度
Mg/dlmmol/L
5.00
10.00
20.00
30.00
40.00
100
100
100
100
100
502.78
1005.55
20011.10
30016.65
40022.20
安息香酸稀释液中一部分是用于配制试剂空白的，它用作“0”浓度标准液。
一次配制一套完整系列标准液，如果任何一个浓度减少或有怀疑，整批都将被替换。
旧的和新的系列标准通过一个分析批双份分析测试进行比较。
（b）工作标准液贮存于4-ounce聚乙烯螺旋帽瓶中，放4℃不超过1个月。
塑料存贮瓶的清洗很关键，交叉污染不被发现，对测定的影响会从一种溶液倒另一种溶液。
尽管安息香酸是一种很好的抗常规糖酵解微生物的防腐剂，它不能防御严重的细菌污染。
（c）在每一分析日中，要求平衡至25℃的工作标准重新分到干净管中，原液瓶重新放回冰箱。
b试剂配制
（1）沉淀蛋白试剂
（a）ZnSO4溶液（22g/l）：
用刚配好的热的无CO2蒸馏水大约900ml溶解22gZnSO4。
7H2O，溶液冷却至室温后，移到1L容量瓶中，用无CO2水稀释至1000ml充分混匀，移至玻璃瓶，密闭保存。
（b）饱和Ba（OH）2溶液，用刚配好的热的无CO2蒸馏水约950ml溶解刚开瓶称取的80gBa（OH）2。
8H2O，溶液冷至室温，移到1L容量瓶中，用无CO2蒸馏水稀释至1000ml，充分混匀，转移到存储瓶中，存储瓶用短圆柱形指示型SIO2凝胶（硅胶）保护碱石灰咀，咀的寿命相当短，碱石灰必须经常更换。
允许超量的Ba（OH）2和不溶解的碳酸盐沉淀过夜或几天，必要时，稀释前清除它。
（d）Ba（OH）2溶液，0.11N。
如果不干扰沉淀，转移245ml饱和Ba（OH）2到1L容量瓶，用无CO2蒸馏水稀释至1000ml，用这个稀释的Ba（OH）2溶液滴定10ml硫酸锌溶液用酚酞做指示剂（0.5%指示剂溶解于95%乙醇中，2滴）滴至淡粉色为终点，结果应为10mlZnSO4溶液需要10±0.1mlBa（OH）2溶液滴定。
若超过这个范围，在Ba（OH）2溶液中根据大致计算量加入适量Ba（OH）2或无CO2水，重新滴定。
转移校正好的Ba（OH）2溶液至使用碱石灰咀和苏打水瓶或细水瓶管试剂瓶中，每个月用滴定法检查该溶液当量浓度。
（2）25℃时，PH7.5的0.1mTrisbuffer,含5.0mmol/l乙酸镁
（a）TRIS-HCL原液，在2.0L的容量瓶中用试剂水溶解31.52gTRIS-HCL并稀释到2000ml。
（b）Trisbase原液：
在500ml容量瓶中用试剂水溶解6.06gTrisbase并稀释至500ml。
配制酶试剂时需新鲜配制这个原液。
（c）PH7.5Tris-Mgbuffer，在一个大烧杯里，混合800mlTris-HCL液和200ml的Trisbase溶液，然后在溶液里溶解1.1g醋酸镁。
在25℃测定混合液的PH，必要时，用Tris-HCL液或Trisbase溶液调至PH7.5±0.1。
用0.45μm滤菌膜过滤溶液，到一个无菌带螺旋帽的硼硅酸盐玻璃贮存瓶中，配酶试剂时要新鲜配制，贮存于4℃冰箱。
C：
酶试剂的准备与分析
（1）酶试剂成分的本质分析
（a）试剂
（ⅰ）Tris-白蛋白：
在250ml容量瓶中用Tris-Mgbuffer溶解0.5g牛血清白蛋白，校正至250ml。
储存在大约4℃冰箱。
（ⅱ）NAD+原液：
在Tris-Mg缓冲液中溶解0.9952g氧化型NAD+，补足至250ml，在4℃冰箱保存，配制当天测定。
（ⅲ）ATP原液：
在Tris–Mgbuffer中溶解0.8268gATP二钠盐，并补足至250ml，保存于4℃冰箱，配制当天测定。
（ⅳ）葡萄糖，用0.1%安息香酸稀释60ml葡萄糖标准原液至100ml，保存在4℃冰箱。
（ⅴ）己糖激酶原液：
在25℃称量或用Darrow和Colowick的方法或使用6-磷酸葡萄糖脱H酶的方法测定酶含量获得总活性1250U的己糖激酶，转移至250ml酶的容量瓶，用Tris–Mgbuffer调至刻度，放在4℃冰箱保存，配制当天分析。
（ⅵ）6-磷酸葡萄糖脱H酶原液：
在25℃称量或用olive和Levy的方法或用己糖激酶分析的一组相似的方法获得总活性1250U的6-磷酸葡萄糖脱H酶。
用Tris–Mgbuffer溶解至250ml，保存于4℃冰箱，配制当天测定。
注意：
己糖激酶或脱H酶的活性可从厂家说明书提供的分析资料获得，这些信息包括U/瓶（冻干
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