讲稿5食用菌菌种生产.docx

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讲稿5食用菌菌种生产

第5章食用菌菌种生产

1、目的

清楚菌种类型、作用及各制种环节所需的相应设备。

掌握各级菌种的培育技术，知道为何及如何对菌种进行保藏和复壮。

2、重点与难点

重点：

菌种分离；母种、原种、栽培种的培育。

难点：

孢子分离

菌种左右着产品的质量及产量。

要获得高产优质的食用菌产品，必须有标准化纯度高的优质菌种。

在相同栽培条件下，良种比一般品种可增产三成以上，甚至成倍增长。

掌握菌种培育技术是成功从事食用菌生产的关键。

第一节菌种的概述

一、菌种的概念

菌种的优劣主要取决于菌株原有的特性及制种技术的高低。

菌种是特殊生产资料，西方国家都有菌种法，生产菌种的单位会受到很多法律的约束，对生产设施、科研设备，操作人员的技术水平要求很高。

我国菌种市场一直未受到法律的有效制约。

1996年7月农业部颁布了《食用菌菌种暂行管理办法》，虽为时十年之久，基本处于菌种质量难把关，菌种技术难规范、菌种市场难管理的状态中。

值得高兴的是2006年6月1日农业部颁布并开始实施了《食用菌菌种管理办法》，虽然在今后的执行中还会存在很多问题，但终归是有法可依了。

菌种生产经销混乱的原因有三：

技术比较简单、成本低、利润丰厚。

因此吸引了很多无营业执照、无生产许可证、无合格技术人员，设备简陋，手工作坊式生产的单位或个人烟熏火燎的操起了菌种生产生意。

不管或根本不懂菌种优良性是否降低甚至丧失，使大量名不符实的菌种或劣质菌种被应用到生产中，导致食用菌产量、质量低劣，生产效益不高，甚至毁灭性的失败。

给菇农造成了巨大的经济损失，严重挫伤了食用菌生产的积极性。

食用菌的菌种如同庄稼的种子。

食用菌的孢子是传宗接代的个体，但在人工栽培时，直接用孢子播种很难成功，而是用其生长在培养基内的菌丝体作为“种子”的。

经人工培养，扩大繁殖后用于生产的纯次生菌丝体，称为食用菌的菌种。

菌种基本要求：

实行纯培养，不含任何杂菌。

菌种来源：

自然选择，育种技术，野生菌驯化。

得到优良菌株后再进行扩大繁殖，共生产所需。

二、菌种类型

按使用目的分为保藏菌种、实验菌种、生产菌种；按物理性状分为固体菌种和液体菌种；按级别分为一级种、二级种和三级种。

（一）菌种的分级

1、一级种（母种）

用孢子分离、组织分离或基质分离法首次得到的纯菌丝体，称为母种。

因用试管斜面培养基培育，又是进行菌种扩大的基础种，故又称为试管种或一级种。

特点：

菌丝弱、量少、不能直接栽培，必须经驯化和扩大才能用于生产。

2、原种

将母种扩大至大口瓶、较粗放的液体或固体培养基形成的菌种，成为原种。

也称二级种。

作用：

扩大栽培种

特点：

菌丝较多而壮、适应性较强

3、栽培种

将原种移扩至菌种袋或瓶中的粗放培养基上，培养成的菌丝体，称为栽培种。

也叫三级种、袋装种或生产种。

作用：

用于栽培（不能再扩繁菌种，易致退化）

特点：

菌丝更多、更健壮、适应性更强

总生产：

子实体→母种→原种→栽培种→栽培

母种、原种、栽培种都是具有统一血缘关系的祖孙三代，品性相同，只是越来越多，越来越健壮。

菌种生产就是从母种开始，到栽培种为止。

若受设备或技术条件限制，可买现成的母种或原种进行繁衍。

（二）状态不同的菌种

1、固体菌种

用固体培养基培养的菌种为固体菌种。

实际生产中最为常见，设备、工艺、技术要求等较简单。

但菌龄长，菌龄不一致，发酵率低等。

2、液体菌种

采用液体培养基培养的菌种，菌丝体在液体中呈絮状或球状。

工艺、设备、技术要求较高。

液体菌种平均制种时间为3天左右，而固体菌种1级到3级的转代培养一般需2－3个月，液体菌种培养时间是固体菌种的1/10。

液体菌种具有生产周期短、发酵率高、菌龄一致、成本低、接种方便等固体菌种所不可比拟的优势，更有利于食用菌生产标准化、工厂化、周年化生产，是菌种生产的一个方向。

目前液体菌种生产主要有两种，一种是液体菌种深层发酵培养（种于罐培养），一种是摇瓶培养。

前者需要的设备复杂、投资大、无菌操作严格，适用于科研机构和大型食用菌菌种厂。

后者比较简单，但生产量少，适合农村和小规模的食用菌菌种厂。

三、菌种生产程序

无论哪种类型的菌种，其生产程序都是一样的，主要是：

制培养基→灭菌→接种→培养。

其设备也因各生产步骤的所需而不同。

第二节菌种生产主要设备

一、配料设备

（一）原料处理设备

切片机（将木材切成小木片）→粉碎机）→过筛机（晒出木屑中的块状木等杂物）

（二）原料配制、分装设备

搅拌机（将各原料及水分混合、搅拌均匀）→装瓶机（将原料装于菌种瓶）→装袋机（将培养料装入塑料膜制的菌种袋）现已有装瓶装袋两用机械。

二、灭菌设备

因培养菌种的容器、培养基等物品都要经过高温蒸煮，所以最有效的工具是高压锅或常压锅。

这些设备，大家在实验中已经用过，知道了它们的功能和用法。

三、接种设备

接种是将菌种接入培养基的过程．必须在无菌环境中进行无菌操作。

接种室和接种箱等是进行接种的场所，和外界空间隔绝，防止空气流动，经过一定的消毒措施后，室内就可达到无菌状态，防止接种时污染杂菌。

若传入杂菌，就会前功尽弃。

能提供无菌空间的设备有：

（一）接种箱（严密）

用法：

清洁、放所需物品→药喷、熏→紫外灯30分钟。

（使用前后用2%来苏擦净，箱温勿超30℃）

特点：

结构简单，造价低廉，消毒彻底，移动方便。

但箱内容量小、操作不便，但工效低。

（二）接种室（无菌操作房）

规格：

7~9m2，高2.2~2.5m2，其中缓冲间2~3m2、接种间5~6m2。

要求：

严密、6个面平滑、两门错开、平拉式、顶有紫外灯。

特点：

工效高、造价高　　

用法：

物放缓冲间一消毒、开紫外灯一穿拖鞋、2%来苏水浸手2min一移物于接种间，喷5%石碳酸，退至缓冲间5~10min—完后喷5%石碳酸、开紫外灯。

（问题：

为何不直接放物于缓冲间？

）

接种箱及接种室经常用石灰水等碱性消毒剂擦拭，以改变经常熏蒸造成的酸性环境，保证消毒效果。

（三）超净工作台

使一定工作区达到相对无菌、无尘状态的电器。

特点：

操作舒、工效高

用法：

预开机30min（置洁净处，定期清洗）

（四）接种工具　　

要求：

导热好、冷却快　　

种类：

环、针，铲、耙、钩、匙、镊、刀　　

四、菌种培养设备　　

（一）培养箱　　

培养少量菌种的恒温电器。

一般在20~40℃任意调节。

用法：

打开电源（红灯亮）→旋至所需温度，待温度表达到所需温度时→定温（反旋至红灯灭、绿灯即亮时止）→菌种长好关闭电源　　

（二）培养室

培养大量菌种的恒温房。

培养室最重要的是要恒温、恒湿、无尘且空气流通。

温度应维持在25℃左右，相对湿度应在50%~60%。

培养室内有培养架、紫外线灯。

进入培养室最好穿干净拖鞋或穿一次性鞋套。

要求：

光暗、密闭，好、通风性强；能升温，降温；有培养架、空调机。

大小根据生产规模而定。

五、菌种保藏设备

一般用冰箱保藏母种，大量的原种及栽培种可暂时放置于菌种贮存室。

菌种贮存场所应具备远离污染源及有毒药物、清洁、低温（4~8℃）、干燥、通风、遮光等条件。

在存放菌种之前，应进行消毒杀虫处理，为防杂菌污染，地面可经常撒石灰粉。

原料库

配料间

灭菌间

门口

晒料场

接

种

间

缓

冲

间

栽培场

办公室

培养间

六、菌种厂的布局　　

菌种厂的布局应根据菌种生产流程而进行合理的设置，使各环节成为自然衔接的流水生产线，以便减少污染率，提高生产效率。

第三节菌种培养基

人工配制的，供食用菌生长繁殖的营养基质，称为培养基。

培养基不合适，容易导致菌种退化，失去优良特性。

有无好种在于选，有了好种在于养。

养种的首要环节是制培养基。

一、概述　　

（一）要求

营养种类、营养比例、水分及PH值适宜；持无菌状态。

（二）类型　　　　　　

常用于培养基配制的琼脂具有96℃以上融化、40℃以下凝固；能反复凝、融；

透明度好，粘着力强；不被微生物分解利用等特点。

是制备固化培养基不可缺少的一种理想凝固剂。

天然培养基与半合成培养基具有营养丰富、原料来源广泛、价格低廉等优点，在生产实践中被广泛采用。

液体培养基的养料分布均匀，菌丝生长快，需特殊设备及较高的技术条件，适于机械化、工厂化生产。

但菌种极易老化和自溶，目前食用菌生产仍以固体菌种为主。

斜面及平板培养基常用于母种培养、分离、保藏等。

二、各级菌种的培养基

（一）母种培养基　　

1、通用配方（PDA）　　

马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15~20g，水1000m1。

PDA培养基适于培养绝大多数食用菌母种，是生产中广泛使用的。

2、配制过程　　　

（二）原种和栽培种培养基　　

原种和栽培种的培育方法基本相同，只是在接种时接的菌种级别不一样。

两菌种培养基的配方可以相同，也可有所区别，由于栽培种经过了母种及原种两次的驯化，其培养基可比原种培养基更粗放些。

1、配方与配制　　

（1）颗粒培养基（麦粒、玉米粒等）　　

①配方：

粮食粒98.5%，石膏粉1%，碳酸钙0.5%　　

②配制将洗净的粮食粒洗净，用1%石灰水泡胀，文火煮沸15~20min（熟而不烂，勿破皮），捞出晾至无明水后拌入余料。

原种多使用颗粒培养基。

（2）棉籽壳麦麸培养基　　

①配方：

棉籽壳87%，麦麸10%，白糖1%，石灰1%，过磷酸钙1%。

②配制将棉籽壳、麦麸混合为主料，余料溶解于少量水后浇入主料中。

边加清水边翻拌至含水量达60%~65%（紧握料的指缝中有水泌出而不下滴）。

2、调pH与分装　　

一般用石灰或过磷酸钙调pH至8.0左右（特殊要求除外）。

原种培养基装入菌种瓶（或其他大口瓶），装量约占瓶高的1/2（非颗粒培养基可装至瓶肩，用锥形棒打一料孔），瓶口擦净，堵棉塞后外包牛皮纸或双层报纸。

栽培种培养基一般装入聚丙烯菌种袋，上端套颈圈后如同瓶口包扎法。

两端开口的菌种袋可将两端扎活结。

要求装地外紧内松，培养料需紧贴瓶壁或袋壁。

松散的培养料会导致菌丝断裂及影响对养分、水分的吸收。

三、培养基的灭菌　　

配制的培养基应随即灭菌，以防杂菌滋生，使其腐败变质。

母种培养基多采用高压蒸汽灭菌。

若无较大高压锅，原种、栽培种培养基可采用常压灭菌。

灭菌温度及灭菌时间因培养基不同而不同。

（一）母种培养基的高压蒸汽灭菌　　

1、灭菌及摆斜面

排净冷气后，通常在103kpa（1kg/cm2）压力下，温度约达121℃，灭菌时间为20~30min自然降压至“0”略开锅盖，约60℃摆斜面（约占管长的1/2，温度低盖毛巾，以免形成冷凝水。

2、无菌检验

将斜面培养基放于30℃左右条件下空白培养2~3天，若无杂菌生长，方可用其接种。

（二）原种、栽培种培养基的灭菌　　

原种栽培种培养基的容器大、装量多，应增加灭菌压力及灭菌时间。

若采用高压蒸汽灭菌，一般在152kpa压力（1.5kg/cm2）、温度约128.1℃条件下，保持灭菌时间1~2h。

若采用常压灭菌，需保持最高温度10h左右，再闷1天或1晚。

要求攻头、控中、保尾。

第四节菌种的接种

将少量菌种移接于新培养基中的过程，称为接种。

接种成功的关键是无菌操作。

在移接过程中必须十分谨慎，严防杂菌侵入。

一、无菌操作

（一）概念

在严格消毒灭菌条件下，进行的接种操作。

（二）要求

接种空间、接种工具、操作者的双手都要彻底消毒灭菌

二、母种的接种

简便分离法

1、组织分离（无性繁殖）

将子实体、菌核、菌索等一小块组织放于斜面培养基上，使其萌发为纯菌丝的方法，称为组织分离。

该法具有简便、易成功、能保持原菌种性状等优点，但重复多易退化，应与孢子分离交替进行。

组织分离法适用于绝大多数食用菌（胶质的耳类食用菌除外）。

（1）选种菇选外观典型、大小适中、菌肉肥厚、无病虫害、八成熟、第1~2茬的子实体。

（2）种菇消毒用燃烧的酒精棉球迅速擦拭

（3）取接组织纵剖（撕）菇体，用尖头镊在柄盖交界处取绿豆粒大组织，放入斜面培养基上。

注意：

种菇含水量及组织块勿大

2、孢子分离（有性繁殖）

孢子分离有单孢分离和多孢分离两种方法。

单孢分离由于手术难度大，主要用于杂交育种的研究，生产上较少采用，一般采用多孢分离法。

多孢分离法：

将许多孢子接种到同一培养基上，使其萌发后自由交配成次生菌丝，从而获得纯菌种的方法，称为多孢分离法。

担孢子或子囊孢子是选育优良新品种或杂交育种的好材料，具有生命力强、菌龄小、生活力旺盛、变率高等优点。

由于孢子个体之间有差异，自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。

（1）种菇的处理

选择八分成熟（有菌膜的子实体应处于其膜即将破裂时）的优质子实体，将菌柄切去2/3。

无菌膜的子实体可用75%酒精棉球擦拭消毒；有菌膜的子实体可洗净表面杂物，置于0.1%升汞或0.25%新洁尔灭中浸泡2~3min，用无菌水冲洗2~3次，再用无菌纱布或滤纸吸干菇体表面水分。

（2）收集孢子

①整菇插种法

是一种将消毒好的种菇插在孢子收集器中，使孢子散落于培养皿内的方法。

A、孢子收集器的准备

孢子收集器使用前须用双层纱布包好，在154kpa压力（1.5kg/cm2）下灭菌45min，或干热灭菌1.5h。

B、采孢子

在无菌环境中用0.1%升汞或无菌水浸湿纱布→种菇插入支架→约25℃、24h现孢子粉→无菌环境中去掉种菇，培养皿盖严后将其取出。

C、接种孢子

用接种环沾取少许孢子粉→斜面或平板培养基上划线涂抹→适温培养→挑健壮尖端菌丝转管→纯化（丝长至斜面1/2时再转管）。

也可用无菌水将孢子稀释成悬浮液，用注射器接种到培养基上。

②钩悬法

是一种特别适用于耳类，也适用于伞菌类的多孢分离法。

用无菌操作法将一小块消毒的耳片或菇片悬挂于无菌三角瓶内（装约1cm厚的培养基）→约25℃、24h现孢子粉→取出分离材料→适温培养→挑健壮尖端菌丝转管→纯化

③孢子印分离法

取成熟子实体经表面消毒后，切去菌柄，将菌褶向下放置于灭过菌的有色纸上，在20~24℃静置一天，大量孢子落下形成孢子印，接种环沾少量孢子在试管培养基上划线培养。

孢子分离得到的母种，必须进一步提纯复壮。

选择菌丝健壮、生长旺盛，无老化、无感染杂菌的母种转管扩大。

再通过出菇试验，鉴定为优质菌种后，才可供生产使用。

（二）转管法（传代、扩大）

将母种移入新斜面培养基上的过程，称为转管。

是一项重要的常规操作，常用的工具是接种环。

无论引进或自己分离的母种，都需要适当传代，使之产生大量再生母种，才能源源不断供应生产。

再生母种的生活力常随传代次数的增加而降低，一般传代5次以后就换分离法。

用接种环取绿豆粒大母种（带一薄片培养基）→放于新斜面中部（1支母种约传30支再生母种）。

注意：

原来的种块及斜面尖端取出弃之，严控传代次数。

三、原种、栽培种的接种

灭菌后的原种及栽培种培养基及时运送至无菌环境中，待料温降至约30℃，进行抢温接种。

（一）接原种

用接种耙取蚕豆大母种（连同培养基）→放于瓶中培养料的孔口处（1支母种约接5~8瓶原种）。

注意：

斜面尖端及原来的母种块勿接入。

（二）接栽培种

用大镊子、接种铲、接种匙取枣大原种→放于瓶或袋中料面上（若两端扎活结的菌种袋，每端都要接入原种）。

1瓶原种约接60瓶或25袋栽培种。

注意：

去弃表面老化菌丝及老种块。

第五节菌种的培养与质量鉴定

一、菌种培养

接种后要精心培养，创造有利于菌丝生长的各种环境条件（主要是温度、空气）。

（一）培养条件

培养场所（培养室）清洁，事先要杀虫消毒；光线暗；空气清新；保持20~25℃、60%~70%空气湿度条件。

（二）技术环节

1、母种培养

将斜面朝下斜置、叠放于瓷盘中，放于培养箱中培养。

（1）及时检查2~3天后每天都要检查菌丝生长情况。

及时挑拣污染试管（出现粘膜或杂色）。

（2）分离的母种一定纯化后做出菇试验。

①纯化试管中的菌丝长至斜面1/2时，挑尖丝转管，培养成再生母种。

②出菇试验：

将再生母种扩成原种、栽培种，使其出菇。

看产量、质量、形态、长势、抗性如何，再决定是否取用。

③菌龄适宜菌丝即将长满斜面（一般7~10天）终止培养。

分别用于菌种保藏或繁衍原种。

2、原种、栽培种培养

（1）勿堆放过挤菌种瓶或菌种袋根据气温可单层或多层叠放，隔4~5天转动或调换位置，以利于受温一致，并避免培养料水分的沉积。

（2）常挑拣及时去除出现杂色、粘液及菌种死亡的瓶或袋。

（3）逐渐降温当菌丝长至料深的1/2时，降温2~3℃，以免料温升高，并有壮丝作用。

（4）注意菌龄原种约30~40天、栽培种约20~30天菌丝长满，再继续培养7~10天是使用的最好菌龄。

二、菌种质量的鉴定

菌种质量的优劣是食用菌生产成败的关键，也关系到成千上万栽培者的经济利益。

引进或分离的菌种必须通过鉴定后方可投入生产。

菌种鉴定可从形态、生理、栽培及经济效益等方面进行综合评价。

经检验符合质量标准的菌种，应在出售时贴明质量合格标签，注明菌种种类、级别、品种、生产单位、接种日期等。

（一）母种质量的鉴定

1、外观丝白、整齐，粗壮、有弹性、萌发快；丝干燥，收缩或自溶产生红褐色液体的勿用。

2、耐温湿性鉴定

（1）耐温性适温培养1周→高温（30~35℃）培养24h→再适温培养。

恢复快、不发黄、不倒伏、不萎缩，则为良种。

（2）耐干湿性

（3）出菇鉴定扩成原种、栽培种→出菇（最可靠、有效）

（二）原种、栽培种质量的鉴定

菌丝白（符合该菌种的颜色）、均匀、粗壮、整齐、有菇香味，无杂色、黄水、结皮，一般要求无原基，接种后萌发快。

培养基湿润，不干缩脱壁等。

笫六节菌种保藏及复壮

菌种保藏与复壮是生产中不可缺少的重要环节。

选育出的菌种必须进行适当的保藏及复壮，才能减少变异与衰退，确保菌种的优良性能。

一、菌种保藏

不同的物品又不同的保藏方法。

通常用的晒干、腌渍、蜜饯等方法不适用于保藏有生命的，此外保藏的目的也不一样，菌种的保藏目的要求很高

（一）保藏目的及原理

1、目的

使菌种不死亡、不生长、不污染，保持其优良性状，尽可能长时间地在生产上应用。

死亡和生长都是保藏失败的结果。

2、原理

创造低温、干燥、缺氧、少营养等不利于菌种生长的一切条件，使其代谢降到休眠状态。

（二）保藏方法（只适于母种）

1、斜面低温法

即将长满的斜面种，换胶塞或齐管口剪掉棉塞→蘸腊→放4~6℃冰箱保藏（3~6个月）。

特点：

简便，可随时取用。

但保藏时间短，易污染及退化。

冰箱是保藏菌种的基本设备，靠它的低温降低菌种的代谢。

冰箱只能降温，却不能升温。

注意：

一般每3个月转管一次，用时适温培养12~24h再转管。

草菇不耐低温，须在10~15℃下保藏，或注入防冻剂（10%甘油）再放入冰箱。

2、矿油保藏法

无色透明、粘稠、不被微生物分解的矿油灌注入菌种管中，淹没斜面，以隔绝空气、防止水分散失、抑制菌种代谢，达到菌种保藏目的。

矿油装三角瓶在147kpa压力（1.5kg/cm2）下灭菌30min→40~50℃培养箱中烘至由浑变清（去水）→无菌检验后，注入种管，高出斜面1cm，→一口堵胶塞（保藏2年，用时转管→再转管）

该法创造的条件是隔绝氧气，防止培养基水分蒸发。

缺点是矿油易燃；只能直立放置。

3、自然基质保藏法

特点：

防衰老、复壮菌丝、保藏时间长、接后生长旺。

但易污染，灭菌要彻底。

（三）注意事项

1、用保种培养基增加有机氮含量；糖降至（2%以下），以防产生能量及酸。

琼脂增至2%~2.5%，以增加持水性。

2、即将长满（2/3）及时保藏。

3、最好换胶塞。

4、用前活化（重新移至新斜面上，活化前应适温放置12~24h）。

5、防止棉塞受潮、琼脂培养基干缩、杂菌污染等现象。

二、菌种复壮

菌种经长期人工培养及保藏，难免引起某些优良性状的减弱或丧失，必须及时进行菌种复壮。

菌种的使用、保藏、复壮应密切结合。

保藏，复壮都是为使用服务的，不会保藏、复壮菌种，就容易使好种退化或者绝种。

确保或恢复菌种优良性能的措施，称为复壮。

菌种复壮是菌种生产中不可缺少的一项重要技术，是防止菌种退化的有效措施。

（一）衰退表现及根源

1、表现

生长慢、抗性差、形态变、产量及质量下降。

2、根源　

外因是传代过多，条件不适宜；内因是菌种遗传物质发生了不良变异。

（二）复壮法

1、无性繁殖与有性繁殖交替转管多次的菌种改用组织分离，可有明显复壮作用。

无性繁殖较多的品种应改用孢子分离法，重新获得优良菌株后再进行转管使用。

2、改变培养条件经常变换营养成分或添加酵母膏、氨基酸、维生素等，以提高菌种活力。

反复使用单一配方，易导致菌种退化。

3、挑尖丝转管每当接种时，都要取接年幼的尖端菌丝，以不断淘汰老化菌丝。

（三）防止衰退的有效措施　　

1、保证菌种的纯培养，不用被杂菌污染的菌种。

2、严格控制菌种传代次数，尽量减少机械损伤，保证菌种活力。

3、菌种不宜过长时间使用，使用适宜菌龄的菌种。