利多卡因通过抑制NFκB的活化减轻大鼠内毒素性肺损伤.docx

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利多卡因通过抑制NFκB的活化减轻大鼠内毒素性肺损伤

利多卡因通过抑制NF-κB的活化减轻大鼠内毒素性肺损伤

徐州医学院附属医院麻醉科，江苏徐州221002

封光刘苏王光磊刘功俭*

[摘要]目的：

探讨利多卡因对大鼠内毒素性肺损伤的保护作用及其机制。

方法：

SD大鼠随机分为1）control组（0.9%sodiumchloride）;2）LPS组;3）LPS+lido1mg/kg组;4）LPS+lido2mg/kg组;5）LPS+lido4mg/kg组，其中LPS组和LPS+lido4mg/kg组又根据腹腔注射内毒素到取肺组织或收集血液标本的时间分为1、3、6、12h亚组。

Western印迹检测大鼠肺组织核内NF-κB和胞浆IκBα的表达，ELISA检测血清TNF-α及IL-6的水平，观察大鼠肺组织病理变化。

结果：

大鼠腹腔注射内毒素后，肺组织核内NF-κB的表达明显增多，血清TNF-α及IL-6的水平明显升高，胞浆IκBα表达显著减少，病理切片示肺组织结构破坏严重。

应用利多卡因后，与LPS组相比，核内NF-κB的表达明显减少，胞浆中IκBα表达显著增加，血清中TNF-α及IL-6的水平也明显降低，肺组织结构的破坏有明显减轻。

结论：

应用利多卡因能明显抑制内毒素引起的NF-κB的活化和TNF-α、IL-6的表达。

提示利多卡因的肺保护作用机制可能与抑制NF-κB的活化，进而抑制炎症反应有关，而利多卡因对NF-κB活化的抑制可能与其抑制IκBα的降解有关。

Summary

BackgroundandObjectives:

Lidocainehasbeenreportedtoattenuatetheinflammatoryresponseinadditiontoitsanestheticactivity,butthemechanismsarepoorlyunderstood.TheobjectiveofthisstudyistodetermineifLidocainepriortoendotoxemiadiminishespulmonarydysfunctionbyblockingtheNF-kappaBactivation.Methods:

Ratswereassignedto:

1）control（0.9%sodiumchloride）;2）LPS;3）LPS+lido1mg/kg;4）LPS+lido2mg/kg;5）LPS+lido4mg/kg.LPSandLPS+lido4mg/kggroupsweresubjectedto1h、3h、6hand12htimepoint.ToinvestigatetheactivationofNF-kappaB,theexpressionofNF-kappaBinthenuclearandIkappaBalphainthecytosolwereanalyzedbywesternblot.TheconcentrationofTNF-alphaandIL-6inserumwasdetectedbyELISA.ThepathologicchangesoflungwereobservedusingHEstaining.Results:

Afteri.p.injectionofLPS,theexpressionofNF-kappaBinthenuclearextractswassignificantlyincreasedandIkappaBalphainthecytosolextractswasmarkedlydecreased.TheconcentrationofTNF-alphaandIL-6inserumwasincreased.Pathologicalexaminationshowedthatthenormalstructureoflungwasdestroyedbadly.HoweverLidocainereversedaboveresults.Conclusion:

LidocaineattenuatesLPS-inducedlunginjuryviamechanismsinvolvinginhibitingNF-kappaBactivationandcytokinesrelease,whichimpliesLidocainemaybeasapotentialanti-inflammatoryagentinendotoxemia.

利多卡因通过抑制NF-κB的活化减轻大鼠内毒素性肺损伤

[摘要]目的：

探讨利多卡因对大鼠内毒素性肺损伤的保护作用及其机制。

方法：

SD大鼠随机分为1）control组（0.9%sodiumchloride）;2）LPS组;3）LPS+lido1mg/kg组;4）LPS+lido2mg/kg组;5）LPS+lido4mg/kg组，其中LPS组和LPS+lido4mg/kg组又根据腹腔注射内毒素到取肺组织或收集血液标本的时间分为1、3、6、12h亚组。

Western印迹检测大鼠肺组织核内NF-κB和胞浆IκBα的表达，ELISA检测血清TNF-α及IL-6的水平，观察大鼠肺组织病理变化。

结果：

大鼠腹腔注射内毒素后，肺组织核内NF-κB的表达明显增多，血清TNF-α及IL-6的水平明显升高，胞浆IκBα表达显著减少，病理切片示肺组织结构破坏严重。

应用利多卡因后，与LPS组相比，核内NF-κB的表达明显减少，胞浆中IκBα表达显著增加，血清中TNF-α及IL-6的水平也明显降低，肺组织结构的破坏有明显减轻。

结论：

应用利多卡因能明显抑制内毒素引起的NF-κB的活化和TNF-α、IL-6的表达。

提示利多卡因的肺保护作用机制可能与抑制NF-κB的活化，进而抑制炎症反应有关，而利多卡因对NF-κB活化的抑制可能与其抑制IκBα的降解有关。

[关键词]：

利多卡因；核因子-κB；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-6；内毒素；肺损伤

急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是由严重感染、创伤和体克等多种病因所致的弥漫性肺实质损伤，其在分子水平上表现为众多促炎性细胞因子、粘附分子的过度表达，伴有多种炎症介质的产生。

上述炎症形成级联反应，导致肺组织广泛损害，并累及诸多肺外器官，其中，核因子-κB（NF-κB）在调控炎症介质的基因表达上起着关键作用。

多种炎症介质基因的启动子和增强子中含有κB位点，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等。

活化的NF-κB可调控上述介质基因的表达。

最近的研究证明酰胺类局麻药利多卡因有着显著的抗炎特性[1,2,3]，因此本实验建立大鼠内毒素性肺损伤模型，探讨利多卡因对大鼠内毒素性肺损伤的保护作用及其机制[4-6]。

材料与方法

实验动物及主要试剂：

雄性SD大鼠（由徐州医学院实验动物中心提供）250－300g，LPS（E.Coli0127:

B8）购自sigma公司，NF-κBp65多克隆抗体，IκBα（NF-κB阻遏蛋白）多克隆抗体（SantaCruz公司），TNF-α及IL-6酶联免疫（ELISA）试剂盒（美国R&D公司），利多卡因（第二军医大学朝晖制药厂），HE染液（江苏海门碧云天公司）。

SD大鼠随机分为1）control组（0.9%sodiumchloride）;2）LPS组;3）LPS+lido1mg/kg组;4）LPS+lido2mg/kg组;5）LPS+lido4mg/kg组，其中LPS组和LPS+lido4mg/kg组又根据腹腔注射内毒素到取肺组织或收集血液标本的时间分为1、3、6、12h亚组。

参照SabrinaM.Heidemann的实验[7]，采用腹腔注射LPS8mg/kg（5mg/ml）制作内毒素性肺损伤模型，control组注射同体积的生理盐水。

LPS+lido组在注射腹腔注射内毒素前10min，尾静脉注射利多卡因4mg/kg（10mg/ml），而LPS组和control组给予同体积的生理盐水。

按分组规定的时间点，10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，取出肺组织。

右肺下叶，-80℃冻存，用于Western印迹分析，左肺上叶做石蜡切片用于HE染色病理切片。

1、肺组织石蜡切片的制备：

各组实验大鼠分别在相应的时间点，采用10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，经4％多聚甲醛心脏灌注固定后，取左肺上叶，浸泡固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切成4m厚的连续石蜡切片。

2、蛋白质印迹（Western印迹）检测：

从液氮中取出肺组织，加1.5mlBufferA（含10mMHEPES,pH7.9,0.5mMMgCl2,10mMKCl,0.1mMEDTA,0.1mMEGTA,50mMNaF,1mMDTT,30mM-phosphoglycerol,1mMNa3VO4,1mMbenzamidineandenzymeinhibitors:

0.5mMPMSF,10µg/mlaprotinin,10µg/mlleupeptin,10µg/mlpepstatinAand1mMPNPP）。

用电动匀浆器高速匀浆（10秒×6次），加入10%的NP-4090l，剧烈振荡30S，800g×15min离心，上清液为胞浆部分。

后在沉淀物中加入500lBufferB（20mMHEPES,pH7.9,20%glycerol,0.42MNaCl,0.5mMMgCl2,1mMEDTA,1mMEGTA,1mMDTTandenzymeinhibitors:

0.5mMPMSF,10µg/mlaprotinin,10µg/mlleupeptin,10µg/mlpepstatinAand1mMPNPP），4℃转摇30min，12,000g×15min离心，取上清为胞核成分，胞浆和胞核测蛋白后分装，置-80℃冰箱待用。

蛋白含量测定按改良Lowry法[8]，以牛血清白蛋白作为标准蛋白。

按Gu等方法[9]作稍微改动，等量蛋白样品经10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，以干转法电转移至NC膜上，转移缓冲液为25mMTris,192mM甘氨酸，20%（v/v）甲醇,pH8.3，转移条件为稳流：

电流大小（A）=膜面积（cm2）×2.5，时间30min。

转移后的NC膜经3%BSA室温封闭3h后加入适当稀释的一抗，室温4h或4℃过夜。

用缓冲液（10mMTris,pH7.4，0.1mol/LNaCl,0.1%Tween-20）洗膜三遍，加入相应酶标二抗，37℃反应2h，缓冲液洗膜三遍。

以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。

结果以UVP图像分析仪（GeneCompany）分析处理。

3.酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中TNF-α和IL-6：

收集血液标本，取出试剂盒平衡至室温（20℃~25℃），浓缩洗涤液用双蒸水稀释1倍（至500ml），加入10μl标准品，10μl血浆于相应反应板孔中，每孔加入40μlAnti-ratTNF-αBiotin和40μlAnti-ratTNF-αPOD。

轻轻混匀30秒，封住板孔，室温温育45分钟。

洗板，甩尽板内液体，用洗板机洗涤反应板（每孔内加入洗涤液350μl）5遍。

每孔加入100μl显色液，轻轻混匀10秒，室温温育20分钟，每孔加入100μl终止液，轻轻混匀30秒；30分钟内在450nm处读OD值，以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。

根据血清样品的OD值在标准曲线上查出其浓度。

IL-6的测量基本相同。

4、肺组织病理检查：

石蜡切片经常规脱蜡、水化。

苏木素染液5分钟，浸自来水中冲洗掉多余的染液，约10分钟。

蒸馏水再洗涤一次数秒，95％乙醇5秒，伊红染液30秒，常规脱水、透明、封片后，光镜下观察肺组织形态学变化。

5、统计学处理：

数据以均数±标准差（meanSD）表示，统计分析采用单因素方差分析（ANOVA），多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法（LSD），实验组之间比较采用q检验（Newman-keulstest），p<0.05为统计学有显著性差异。

结果

1.Western印迹检测NF-κB表达结果（图.1）：

control组大鼠肺组织的细胞核内中仅见有微量NF-κB的表达;LPS组核内NF-κB的表达量从注射内毒素后1h就开始显著增加，3h达到高峰，6h已经有所恢复，但直到12h仍显著的高于control组；在LPS+lido4mg/kg组，应用利多卡因后能明显的抑制内毒素引起的核内NF-κB的表达。

和LPS组相比，LPS+lido4mg/kg组在1、3、6、12h四个时间点核内NF-κB的表达量都显著的低于LPS组。

图.1NF-κB在大鼠肺组织细胞核中的表达水平（

±s,n=6）

注：

与control组相比，*P<0.05；同一时间点与LPS组相比，#P<0.05

2.Western印迹检测IκBα（NF-κB阻遏蛋白）的表达结果（图.2）：

大鼠注射内毒素后1h，肺组织胞浆中IκBα的表达量就开始显著的下降，3h和6h处于较低水平，12hIκBα的表达量也显著的小于control组；和LPS组相比，LPS+lido4mg/kg组在1、3、6、12h四个时间点IκBα的表达量都显著的高于LPS组，应用利多卡因能显著抑制内毒素引起的胞浆IκBα的降解。

图.2IκBα在大鼠肺组织细胞浆中的表达水平（

±s,n=6）

注：

与control组相比，*P<0.05；同一时间点与LPS组相比，#P<0.05

3.肺组织病理切片的结果（图.3）：

control组在光镜可见肺泡结构完整，肺泡壁无水肿，无炎症细胞浸润；LPS组可见片状出血，光镜下可见基本上看不到完整的肺泡结构，肺间质有严重的水肿、淤血，大量的炎症细胞浸润；LPS+lido4mg/kg组，肺泡结构受到轻微破坏，能看到代偿增大的肺泡，无明显的水肿、淤血，仅有少量的炎症细胞浸润。

图.3腹腔注射内毒素后6小时的病理（HE×400）

注：

（a）controlgroup;（b）LPSgroup;（c）LPS+lido1mg/kggroup;（d）LPS+lido2mg/kggroup;（e）LPS+lido4mg/kggroup

4.ELISA检测血清中TNF-α和IL-6的结果（图.4、图.5）：

在LPS组，腹腔注射LPS后，血清中TNF-α和IL-6的水平均显著升高，TNF-α的水平于3h达到高峰，而IL-6的水平则随着时间的延长逐渐升高；和LPS组相比，LPS+lido4mg/kggroup在1、3、6、12h四个时间点TNF-α和IL-6的表达量都显著的低于LPS组，应用利多卡因能显著抑制内毒素引起的血清TNF-α和IL-6的升高。

图.4大鼠血清TNF-α的表达水平（

±s,n=6）

注：

与control组相比，*P<0.05；同一时间点与LPS组相比，#P<0.05

图.5大鼠血清IL-6的表达水平（

±s,n=6）

注：

与control组相比，*P<0.05；同一时间点与LPS组相比，#P<0.05

5.Western印迹检测不用剂量利多卡因下NF-κB的表达结果（图.6）：

应用2mg/kg和4mg/kg的利多卡因都可以明显的抑制内毒素引起的核内NF-κB表达的增多。

其中以4mg/kg时，利多卡因的这种抑制作用最为明显。

图.6NF-κB在大鼠肺组织细胞核中的表达水平（

±s,n=6）

注：

与control组相比，*P<0.05；同一时间点与LPS组相比，#P<0.05

6.Western印迹检测不用剂量利多卡因下IκBα的表达结果（图.7）：

应用2mg/kg和4mg/kg的利多卡因都可以明显的抑制内毒素引起的胞浆IκBα降解的增多。

其中以4mg/kg时，利多卡因的这种抑制作用最为明显。

Fig.7

（a）

（b）

图.7IκBα在大鼠肺组织细胞浆中的表达水平（

±s,n=6）

注：

与control组相比，*P<0.05；同一时间点与LPS组相比，#P<0.05

讨论

内毒素感染可引发机体的早期保护性炎症反应，但过度或失控的炎症反应则可引起全身难以控制的“瀑布式炎症级联反应”，从而发生ALI，进而发生SIRS和MODS。

细菌内毒素可以激活信号转导系统，导致NF-κB的转位和促炎因子编码基因的活化，诱导TNF-α、IL-6等一些有害细胞因子的合成与释放，而这些细胞因子可以引起肺组织淋巴细胞浸润，由淋巴细胞产生的炎症因子又可以引起低血压、酸中毒和组织损伤最终导致器官功能障碍和死亡。

NF-κB是参与炎症反应的一个重要转录因子，广泛存在于真核细胞中参与许多基因表达的调控。

正常情况时NF-κB为p65和p50两个亚单位组成的异源二聚体，NF-κB通常与κB抑制蛋白（IκBα）结合成无活性的形式存在少胞浆中，抑制NF-κB的核易位，使之保留于胞浆。

当其受氧自由基、内毒素、细胞因子等的刺激后被激活，IκBα被磷酸化而降解，导致NF-κB从细胞浆移位进入细胞核内，与DNA链上的特异性位点结合，从而启动基因转录，调控相应的靶基因表达。

根据以上机制，并参照KazuyukiNakajima的实验[10]，所以本实验采用检测核内NF-κB和胞浆IκBα的表达来反应NF-κB的激活程度。

活化的NF-κB可促使细胞因子（如TNF-α、IL-6）,黏附分子（如ICAM-1）,细胞表面受体，酶类和急性期蛋白等的表达增加。

这些被诱导产生的基因产物可进一步参与炎症和免疫反应，在机体生理和病理条件下发挥重要的功能。

不适当或过度增强NF-κB的活性可引起许多与炎症相关的疾病：

包括SIRS、败血症体克、ARDS、局部缺血和再灌注损伤等。

Nakamori等[11]发现与健康志愿者比较，S1RS患者多形核白细胞核内NF-κB活性显著增高，多形核白细胞的氧化活性也显著增高。

有研究证实NF-κB的活性增高与脓毒血症相关，核内NF-κB的水平与临床表现的严重程度和死亡率有很大的相关性。

脓毒症患者中性粒细胞的凋亡率明显下降，而抑制NF-κB的核转移可以使中性粒细胞的凋亡恢复到基础水平，在脓毒症模型中，抑制NF-κB的活性可以减轻急性炎症过程和器官哀竭；而NF-κB过度激活后释放出大量活性氧、蛋白酶、炎性介质，形成微血栓，从而参与SIRS/MODS的发生[12,13]。

在本实验中，肺组织病理学观察证实，control组光镜下肺组织形态及结构均正常。

LPS组可见正常肺泡结构基本消失，肺间质淤血水肿，大量炎症细胞浸润，肺部病变较重。

LPS＋lido组上述改变较LPS组明显减轻。

表明利多卡因对内毒素引起的肺组织损伤的保护作用是明显的。

本实验用针对p65亚单位的抗体来反映NF-κB的表达，免疫印迹分析结果发现LPS组和LPS+lido组肺组织胞核中NF-κB蛋白含量高于control组，提示ALI的发病与NF-κB的活化有关;而LPS+lido组NF-κB表达增强幅度较低，与LPS组相比有明显差异。

提示利多卡因减少ALI时NF-κB在肺组织中胞核内的表达，从而抑制或中断炎症级联反应减轻肺损伤的程度。

同时LPS+lido组胞浆IκBα的蛋白含量显著高于LPS组，一方面更加证实了利多卡因对NF-κB活化的抑制，也提示利多卡因抑制核因子κB的激活可能是其抑制内毒素引起的IκBα降解的结果。

但对于利多卡因抑制IκBα的降解，机制仍不清楚，需要进一步的实验研究。

TNF-α是急性肺损伤时前炎症介质[14,15]，TNF-α的含量改变可反映其他炎症因子的改变情况[16-19]，所以本文选择该指标进行观察。

实验结果提示利多卡因可以降低内毒素引起的血清中TNF-α的升高。

经相关分析发现肺组织中NF-κB的表达与血清中TNF-α的含量呈正相关，表明利多卡因减少了NF-κB在胞核中的表达，从而可能抑制了TNF-α的合成，减轻了炎症反应。

NF-κB与TNF-α的关系密切，NF-κB是TNF-α的转录调控因子[20-22]，同时TNF-α又是NF-κB的强烈激活剂。

这种正反馈调节机制易导致ALI时炎症反应的扩大和持续。

本实验中利多卡因可削弱这种正反馈反应，减少肺组织中NF-κB和血清中TNF-α的含量从而抑制炎症反应，减轻肺损伤的程度。

血清中IL-6是一种迟发性细胞因子，可以作为细胞因子级联反应激活的一个标志[23]，反映出宿主炎症反应与疾病严重程度间的关系，并且在脓毒血症中可以作为判断预后的一个指标[24]。

本研究中利多卡因通过抑制NF-κB的激活，进而抑制了内毒素引起的血清中IL-6的升高。

总之，本实验证实应用利多卡因后能明显抑制内毒素引起的NF-κB的活化和TNF-α、IL-6的表达。

提示利多卡因的肺保护作用机制可能与抑制NF-κB的活化，进而抑制炎症反应有关，而利多卡因对NF-κB的活化的抑制可能与其对IκBα降解的抑制有关。

参考文献

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2.BlackwellTSChristmanJW.Theroleofnuclearfactor-kappaBincytokinegeneregulation.AmJRespirCellMolBiol1997;17:

3-9.

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4.AbrahamE.Nuclearfactor-kappaBanditsroleinsepsis-associatedorganfailure.JInfectDis2003;187Suppl2:

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5.SiebenlistU,FranzosoGBrownK.Structure,regulationandfunctionofNF-kappaB.AnnuRevCellBiol1994;10:

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6.OrianA,WhitesideS,IsraelA,StancovskiI,SchwartzALCiechanoverA.Ubiquitin-mediatedprocessingofNF-kappaBtranscriptionalactivatorprecursorp105.Recons