利多卡因通过抑制NFκB的活化减轻大鼠内毒素性肺损伤.docx

1、利多卡因通过抑制NFB的活化减轻大鼠内毒素性肺损伤利多卡因通过抑制NF-B的活化减轻大鼠内毒素性肺损伤徐州医学院附属医院麻醉科，江苏 徐州 221002封光 刘苏 王光磊 刘功俭* 摘要 目的：探讨利多卡因对大鼠内毒素性肺损伤的保护作用及其机制。方法： SD大鼠随机分为1) control组 (0.9% sodium chloride); 2) LPS组; 3) LPS +lido1mg/kg组; 4) LPS +lido2mg/kg组; 5) LPS +lido4mg/kg组，其中LPS组和LPS +lido4mg/kg组又根据腹腔注射内毒素到取肺组织或收集血液标本的时间分为1、3、6、12

2、h亚组。Western印迹检测大鼠肺组织核内NF-B和胞浆IB的表达，ELISA检测血清TNF-及IL-6的水平，观察大鼠肺组织病理变化。结果：大鼠腹腔注射内毒素后，肺组织核内NF-B的表达明显增多，血清TNF-及IL-6的水平明显升高，胞浆IB表达显著减少，病理切片示肺组织结构破坏严重。应用利多卡因后，与LPS组相比，核内NF-B的表达明显减少，胞浆中IB表达显著增加，血清中TNF-及IL-6的水平也明显降低，肺组织结构的破坏有明显减轻。结论：应用利多卡因能明显抑制内毒素引起的NF-B的活化和TNF-、IL-6的表达。提示利多卡因的肺保护作用机制可能与抑制NF-B的活化，进而抑制炎症反应有关

3、，而利多卡因对NF-B活化的抑制可能与其抑制IB的降解有关。SummaryBackground and Objectives: Lidocaine has been reported to attenuate the inflammatory response in addition to its anesthetic activity, but the mechanisms are poorly understood. The objective of this study is to determine if Lidocaine prior to endotoxemia diminishe

4、s pulmonary dysfunction by blocking the NF-kappa B activation. Methods: Rats were assigned to: 1) control (0.9% sodium chloride); 2) LPS; 3) LPS +lido1mg/kg; 4) LPS +lido2mg/kg; 5) LPS +lido4mg/kg. LPS and LPS+lido4mg/kg groups were subjected to 1h、3h、6h and 12h time point. To investigate the activa

5、tion of NF-kappa B, the expression of NF-kappa B in the nuclear and I kappa B alpha in the cytosol were analyzed by western blot. The concentration of TNF-alpha and IL-6 in serum was detected by ELISA. The pathologic changes of lung were observed using HE staining. Results: After i.p. injection of L

6、PS, the expression of NF-kappa B in the nuclear extracts was significantly increased and I kappa B alpha in the cytosol extracts was markedly decreased. The concentration of TNF-alpha and IL-6 in serum was increased. Pathological examination showed that the normal structure of lung was destroyed bad

7、ly. However Lidocaine reversed above results. Conclusion: Lidocaine attenuates LPS-induced lung injury via mechanisms involving inhibiting NF-kappa B activation and cytokines release, which implies Lidocaine may be as a potential anti-inflammatory agent in endotoxemia.利多卡因通过抑制NF-B的活化减轻大鼠内毒素性肺损伤摘要 目的

8、：探讨利多卡因对大鼠内毒素性肺损伤的保护作用及其机制。方法： SD大鼠随机分为1) control组 (0.9% sodium chloride); 2) LPS组; 3) LPS +lido1mg/kg组; 4) LPS +lido2mg/kg组; 5) LPS +lido4mg/kg组，其中LPS组和LPS +lido4mg/kg组又根据腹腔注射内毒素到取肺组织或收集血液标本的时间分为1、3、6、12h亚组。Western印迹检测大鼠肺组织核内NF-B和胞浆IB的表达，ELISA检测血清TNF-及IL-6的水平，观察大鼠肺组织病理变化。结果：大鼠腹腔注射内毒素后，肺组织核内NF-B的表达明

9、显增多，血清TNF-及IL-6的水平明显升高，胞浆IB表达显著减少，病理切片示肺组织结构破坏严重。应用利多卡因后，与LPS组相比，核内NF-B的表达明显减少，胞浆中IB表达显著增加，血清中TNF-及IL-6的水平也明显降低，肺组织结构的破坏有明显减轻。结论：应用利多卡因能明显抑制内毒素引起的NF-B的活化和TNF-、IL-6的表达。提示利多卡因的肺保护作用机制可能与抑制NF-B的活化，进而抑制炎症反应有关，而利多卡因对NF-B活化的抑制可能与其抑制IB的降解有关。 关键词：利多卡因；核因子-B；肿瘤坏死因子-；白细胞介素-6；内毒素；肺损伤急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是

10、由严重感染、创伤和体克等多种病因所致的弥漫性肺实质损伤，其在分子水平上表现为众多促炎性细胞因子、粘附分子的过度表达，伴有多种炎症介质的产生。上述炎症形成级联反应，导致肺组织广泛损害，并累及诸多肺外器官，其中，核因子-B（NF-B）在调控炎症介质的基因表达上起着关键作用。多种炎症介质基因的启动子和增强子中含有B位点，如白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-（TNF-）等。活化的NF-B可调控上述介质基因的表达。最近的研究证明酰胺类局麻药利多卡因有着显著的抗炎特性1,2,3，因此本实验建立大鼠内毒素性肺损伤模型，探讨利多卡因对大鼠内毒素性肺损伤的保护作用及其机制4-

11、6。 材料与方法实验动物及主要试剂：雄性SD大鼠（由徐州医学院实验动物中心提供）250300g，LPS（E. Coli 0127:B8）购自sigma公司，NF-B p65 多克隆抗体， IB（NF-B阻遏蛋白）多克隆抗体（Santa Cruz公司），TNF-及IL-6酶联免疫（ELISA）试剂盒（美国R&D公司），利多卡因（第二军医大学朝晖制药厂），HE染液（江苏海门碧云天公司）。SD大鼠随机分为1) control组 (0.9% sodium chloride); 2) LPS组; 3) LPS +lido1mg/kg组; 4) LPS +lido2mg/kg组; 5) LPS +lido

12、4mg/kg组，其中LPS组和LPS +lido4mg/kg组又根据腹腔注射内毒素到取肺组织或收集血液标本的时间分为1、3、6、12h亚组。参照Sabrina M. Heidemann的实验7，采用腹腔注射LPS 8mg/kg（5mg/ml）制作内毒素性肺损伤模型，control组注射同体积的生理盐水。LPS +lido组在注射腹腔注射内毒素前10min，尾静脉注射利多卡因4mg/kg（10mg/ml），而LPS组和control组给予同体积的生理盐水。按分组规定的时间点，10水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，取出肺组织。右肺下叶，-80冻存，用于Western印迹分析，左肺上叶做石蜡切片

13、用于HE染色病理切片。1、肺组织石蜡切片的制备：各组实验大鼠分别在相应的时间点，采用 10水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，经4多聚甲醛心脏灌注固定后，取左肺上叶，浸泡固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切成4 m厚的连续石蜡切片。2、蛋白质印迹(Western印迹)检测：从液氮中取出肺组织，加1.5 ml Buffer A (含10 mM HEPES, pH 7.9, 0.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 50 mM NaF, 1 mM DTT, 30 mM -phosphoglycerol, 1 mM Na3VO4, 1 m

14、M benzamidine and enzyme inhibitors: 0.5 mM PMSF, 10 g/ml aprotinin, 10 g/ml leupeptin, 10 g/ml pepstatin A and 1 mM PNPP)。用电动匀浆器高速匀浆（10秒6次），加入10%的NP-40 90 l，剧烈振荡30 S，800 g15 min离心，上清液为胞浆部分。后在沉淀物中加入500 l Buffer B (20 mM HEPES, pH 7.9, 20% glycerol, 0.42 M NaCl, 0.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1

15、mM DTT and enzyme inhibitors: 0.5 mM PMSF, 10 g/ml aprotinin, 10 g/ml leupeptin, 10 g/ml pepstatin A and 1 mM PNPP)，4转摇30min，12,000 g15 min离心，取上清为胞核成分，胞浆和胞核测蛋白后分装，置-80冰箱待用。蛋白含量测定按改良Lowry法8，以牛血清白蛋白作为标准蛋白。按Gu等方法9作稍微改动，等量蛋白样品经10% 的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，以干转法电转移至NC膜上，转移缓冲液为25 mM Tris, 192 mM甘氨酸，20%(

16、v/v)甲醇, pH8.3，转移条件为稳流：电流大小(A)=膜面积(cm2)2.5，时间30min。转移后的NC膜经3% BSA室温封闭3 h后加入适当稀释的一抗，室温4h或4过夜。用缓冲液（10 mM Tris, pH7.4，0.1 mol/L NaCl, 0.1%Tween-20）洗膜三遍，加入相应酶标二抗，37反应2h，缓冲液洗膜三遍。以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。结果以UVP图像分析仪（Gene Company）分析处理。3.酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中TNF-和IL-6：收集血液标本，取出试剂盒平衡至室温（2025），浓缩洗涤液用双蒸水稀释1倍（至500ml），加入

17、10l标准品，10l血浆于相应反应板孔中，每孔加入40l Anti-rat TNF-Biotin 和 40l Anti-rat TNF- POD。轻轻混匀30秒，封住板孔，室温温育45分钟。洗板，甩尽板内液体，用洗板机洗涤反应板（每孔内加入洗涤液350l）5遍。每孔加入100l显色液，轻轻混匀10秒，室温温育20分钟，每孔加入100l终止液，轻轻混匀30秒；30分钟内在450nm处读OD值，以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据血清样品的OD值在标准曲线上查出其浓度。IL-6的测量基本相同。4、肺组织病理检查：石蜡切片经常规脱蜡、水化。苏木素染液5分钟，浸自来水中冲洗掉多余

18、的染液，约10分钟。蒸馏水再洗涤一次数秒，95乙醇5秒，伊红染液30秒，常规脱水、透明、封片后，光镜下观察肺组织形态学变化。5、统计学处理： 数据以均数标准差（meanSD）表示，统计分析采用单因素方差分析（ANOVA），多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法（LSD），实验组之间比较采用q检验（Newman-keuls test)，p0.05为统计学有显著性差异。结果1. Western印迹检测NF-B表达结果（图.1）：control组大鼠肺组织的细胞核内中仅见有微量NF-B的表达;LPS组核内NF-B的表达量从注射内毒素后1h就开始显著增加，3h达到高峰，6h已经有所恢复，但直到12h

19、仍显著的高于control组；在LPS +lido4mg/kg组，应用利多卡因后能明显的抑制内毒素引起的核内NF-B的表达。和LPS组相比，LPS +lido4mg/kg组在1、3、6、12h四个时间点核内NF-B的表达量都显著的低于LPS组。图.1 NF-B在大鼠肺组织细胞核中的表达水平（s, n=6）注：与control组相比，*P0.05；同一时间点与LPS组相比，# P0.052. Western印迹检测IB（NF-B阻遏蛋白）的表达结果（图.2）：大鼠注射内毒素后1h，肺组织胞浆中IB的表达量就开始显著的下降，3h和6h处于较低水平，12h IB的表达量也显著的小于control组；

20、和LPS组相比，LPS +lido4mg/kg组在1、3、6、12h四个时间点IB的表达量都显著的高于LPS组，应用利多卡因能显著抑制内毒素引起的胞浆IB的降解。图.2 IB在大鼠肺组织细胞浆中的表达水平（s, n=6）注：与control组相比，*P0.05；同一时间点与LPS组相比，# P0.053. 肺组织病理切片的结果（图.3）：control组在光镜可见肺泡结构完整，肺泡壁无水肿，无炎症细胞浸润；LPS组可见片状出血，光镜下可见基本上看不到完整的肺泡结构，肺间质有严重的水肿、淤血，大量的炎症细胞浸润；LPS +lido4mg/kg组，肺泡结构受到轻微破坏，能看到代偿增大的肺泡，无明显

21、的水肿、淤血，仅有少量的炎症细胞浸润。图.3 腹腔注射内毒素后6小时的病理(HE400)注：(a) control group; (b) LPS group; (c) LPS+lido1mg/kg group; (d) LPS+lido2mg/kg group; (e) LPS+lido4mg/kg group4. ELISA检测血清中TNF-和IL-6的结果（图.4、图.5）：在LPS组，腹腔注射LPS后，血清中TNF-和IL-6的水平均显著升高，TNF-的水平于3h达到高峰，而IL-6的水平则随着时间的延长逐渐升高；和LPS组相比，LPS+lido4mg/kg group在1、3、6、12

22、h四个时间点TNF-和IL-6的表达量都显著的低于LPS组，应用利多卡因能显著抑制内毒素引起的血清TNF-和IL-6的升高。图.4 大鼠血清TNF-的表达水平（s, n=6）注：与control组相比，*P0.05；同一时间点与LPS组相比，# P0.05图.5 大鼠血清IL-6的表达水平（s, n=6）注：与control组相比，*P0.05；同一时间点与LPS组相比，# P0.055. Western印迹检测不用剂量利多卡因下NF-B的表达结果（图.6）：应用2mg/kg和4mg/kg的利多卡因都可以明显的抑制内毒素引起的核内NF-B表达的增多。其中以4mg/kg时，利多卡因的这种抑制作用

23、最为明显。图.6 NF-B在大鼠肺组织细胞核中的表达水平（s, n=6）注：与control组相比，*P0.05；同一时间点与LPS组相比，# P0.056. Western印迹检测不用剂量利多卡因下IB的表达结果（图.7）：应用2mg/kg和4mg/kg的利多卡因都可以明显的抑制内毒素引起的胞浆IB降解的增多。其中以4mg/kg时，利多卡因的这种抑制作用最为明显。Fig.7(a)(b)图.7 IB在大鼠肺组织细胞浆中的表达水平（s, n=6）注：与control组相比，*P0.05；同一时间点与LPS组相比，# P0.05讨论内毒素感染可引发机体的早期保护性炎症反应，但过度或失控的炎症反应则

24、可引起全身难以控制的“瀑布式炎症级联反应”，从而发生ALI，进而发生SIRS和MODS。细菌内毒素可以激活信号转导系统，导致NF-B的转位和促炎因子编码基因的活化，诱导TNF-、IL-6等一些有害细胞因子的合成与释放，而这些细胞因子可以引起肺组织淋巴细胞浸润，由淋巴细胞产生的炎症因子又可以引起低血压、酸中毒和组织损伤最终导致器官功能障碍和死亡。NF-B是参与炎症反应的一个重要转录因子，广泛存在于真核细胞中参与许多基因表达的调控。正常情况时NF-B为p65和p50两个亚单位组成的异源二聚体， NF-B通常与B抑制蛋白(IB)结合成无活性的形式存在少胞浆中，抑制NF-B的核易位，使之保留于胞浆。当

25、其受氧自由基、内毒素、细胞因子等的刺激后被激活，IB被磷酸化而降解，导致NF-B从细胞浆移位进入细胞核内，与DNA链上的特异性位点结合，从而启动基因转录，调控相应的靶基因表达。根据以上机制，并参照Kazuyuki Nakajima的实验10，所以本实验采用检测核内NF-B和胞浆IB的表达来反应NF-B的激活程度。活化的NF-B可促使细胞因子(如TNF-、IL-6 ) ,黏附分子(如ICAM-1) ,细胞表面受体，酶类和急性期蛋白等的表达增加。这些被诱导产生的基因产物可进一步参与炎症和免疫反应，在机体生理和病理条件下发挥重要的功能。不适当或过度增强NF-B的活性可引起许多与炎症相关的疾病：包括S

26、IRS、败血症体克、ARDS、局部缺血和再灌注损伤等。Nakamori等11发现与健康志愿者比较，S1RS患者多形核白细胞核内NF-B活性显著增高，多形核白细胞的氧化活性也显著增高。有研究证实NF-B的活性增高与脓毒血症相关，核内NF-B的水平与临床表现的严重程度和死亡率有很大的相关性。脓毒症患者中性粒细胞的凋亡率明显下降，而抑制NF-B的核转移可以使中性粒细胞的凋亡恢复到基础水平，在脓毒症模型中，抑制NF-B的活性可以减轻急性炎症过程和器官哀竭；而NF-B过度激活后释放出大量活性氧、蛋白酶、炎性介质，形成微血栓，从而参与 SIRS/ MODS的发生12,13。在本实验中，肺组织病理学观察证实

27、，control组光镜下肺组织形态及结构均正常。LPS组可见正常肺泡结构基本消失，肺间质淤血水肿，大量炎症细胞浸润，肺部病变较重。LPSlido组上述改变较LPS组明显减轻。表明利多卡因对内毒素引起的肺组织损伤的保护作用是明显的。本实验用针对p65亚单位的抗体来反映NF-B的表达，免疫印迹分析结果发现LPS组和LPS+lido组肺组织胞核中NF-B蛋白含量高于control组，提示ALI的发病与NF-B的活化有关;而LPS+lido组NF-B表达增强幅度较低，与LPS组相比有明显差异。提示利多卡因减少ALI时NF-B在肺组织中胞核内的表达，从而抑制或中断炎症级联反应减轻肺损伤的程度。同时LPS

28、+lido组胞浆 IB的蛋白含量显著高于LPS组，一方面更加证实了利多卡因对NF-B活化的抑制，也提示利多卡因抑制核因子B的激活可能是其抑制内毒素引起的 IB降解的结果。但对于利多卡因抑制IB的降解，机制仍不清楚，需要进一步的实验研究。TNF-是急性肺损伤时前炎症介质 14,15，TNF-的含量改变可反映其他炎症因子的改变情况16-19 ，所以本文选择该指标进行观察。实验结果提示利多卡因可以降低内毒素引起的血清中TNF-的升高。经相关分析发现肺组织中NF-B的表达与血清中TNF-的含量呈正相关，表明利多卡因减少了NF-B在胞核中的表达，从而可能抑制了TNF-的合成，减轻了炎症反应。NF-B与T

29、NF-的关系密切，NF-B是TNF-的转录调控因子20-22，同时TNF-又是NF-B的强烈激活剂。这种正反馈调节机制易导致ALI时炎症反应的扩大和持续。本实验中利多卡因可削弱这种正反馈反应，减少肺组织中NF-B和血清中TNF-的含量从而抑制炎症反应，减轻肺损伤的程度。血清中IL-6是一种迟发性细胞因子，可以作为细胞因子级联反应激活的一个标志23，反映出宿主炎症反应与疾病严重程度间的关系，并且在脓毒血症中可以作为判断预后的一个指标24。本研究中利多卡因通过抑制NF-B的激活，进而抑制了内毒素引起的血清中IL-6的升高。总之，本实验证实应用利多卡因后能明显抑制内毒素引起的NF-B的活化和TNF-

30、、IL-6的表达。提示利多卡因的肺保护作用机制可能与抑制NF-B的活化，进而抑制炎症反应有关，而利多卡因对NF-B的活化的抑制可能与其对 IB降解的抑制有关。参考文献1. Wilkins PASeahorn T. Acute respiratory distress syndrome. Vet Clin North Am Equine Pract 2004; 20: 253-273.2. Blackwell TSChristman JW. The role of nuclear factor-kappa B in cytokine gene regulation. Am J Respir Ce

31、ll Mol Biol 1997; 17: 3-9.3. Mikawa K, Maekawa N, Nishina K, Takao Y, Yaku HObara H. Effect of Lidocaine pretreatment on LPS-induced lung injury in rabbits. Anesthesiology 1994; 81: 689-699.4. Abraham E. Nuclear factor-kappaB and its role in sepsis-associated organ failure. J Infect Dis 2003; 187 Su

32、ppl 2: S364-369.5. Siebenlist U, Franzoso GBrown K. Structure, regulation and function of NF-kappa B. Annu Rev Cell Biol 1994; 10: 405-455.6. Orian A, Whiteside S, Israel A, Stancovski I, Schwartz ALCiechanover A. Ubiquitin-mediated processing of NF-kappa B transcriptional activator precursor p105. Recons