重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究.docx

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重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究

表达重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究概述

高应瑞（译）

目前，由于基因组序列数据库的快速扩增，重组蛋白的规模化生产已经成为迫切需要。

因此，通过基因重组生产蛋白质，必须考虑其蛋白特性和活性构象，以确定它们的生物学功能。

如果蛋白质的功能以及其基因的生物学功能未知，无论该蛋白质是在天然结构或在非天然结构，都不能通过生物活性评估来对其进行评估。

至今为止,有越来越多的异源重组蛋白成功得到表达。

其中大肠埃希氏菌（大肠杆菌）是最常使用的表达系统。

然而,在大肠杆菌中异源表达外源基因往往会导致表达蛋白形成不溶性包涵体（IBS）。

包涵体必须经过变性溶解及复性过程后才会恢复其蛋白的生物活性。

包涵体复性过程的是一个非常复杂的过程，往往需要经过大量的反复试验才能确定其复性工艺参数。

在无活性的包涵体到具有生物活性蛋白的过程中，有两个最重要的影响因素:

即包涵体的变性与复性。

包涵体蛋白的溶解必须使其蛋白肽链单分子进行分散并使最大程度减少蛋白质分子肽链内以及肽链之间的相互作用。

溶剂的选择，如尿素，盐酸胍，或洗涤剂等，在包涵体溶解过程中起关键作用，蛋白质变性溶解之后进行复性。

包涵体蛋白溶解后,即可进行蛋白复性。

蛋白复性过程不是单一反应,而蛋白的正确折叠与错误折叠和蛋白聚集的竞争过程。

在蛋白复性的竞争过程中,蛋白的复性率主要取决于变性剂的最终浓度以及溶剂的条件。

本文主要讨论的重点是复性工艺中对变性剂去除方式、溶剂、小分子添加剂以及工艺条件。

小分子添加剂的作用来自其在体内的功能定位。

小分子添加剂能够在生物体缺水的情况下维持体内蛋白质的稳定性，因此被命名为渗透剂[1,2]。

在另一个实例中，基因突变，蛋白的错误折叠常常导致蛋白的失活，从而导致机体生长的异常或某些细胞功能的异常。

实验已证明在某些小分子添加剂的存在时，这些失活蛋白质能够恢复正常功能，而且细胞能够生长正常。

由于小分子能够帮助蛋白质正确折叠，因此他们也被称为化学伴侣。

许多小分子添加剂都是渗透剂和化学伴侣。

因此，可以确定，无论在体外和体内某些小分子能有效地促进蛋白质的正确折叠及稳定蛋白质结构。

1.包涵体蛋白的变性溶解

尿素，盐酸胍，和强离子洗涤剂如N-月桂酰肌氨酸是最常用的溶解剂。

在变性剂溶液中溶解包涵体已经是被公认的一种方法，但是很少有报道，在变性溶液中可能会形成一些低聚合物。

在变性剂溶液中，由于变性剂离子的作用,在蛋白复合物之间产生强大的静电斥力，进而将包涵体分散为单分子结构。

如上所述，在变性剂溶液中形成的蛋白质复合体为非天然二级结构。

然而,只有在这种复杂的蛋白质复合体形成天然二硫键时才会发挥其功能作用。

在月桂酸肌氨酸钠/蛋白质复合物中,观察到了天然及非天然二硫化物的存在，表明在变性剂/蛋白质复合体溶液中有天然和非天然分子内的相互作用（T.ArakawaandT.P.Horan,unpublishedresults）。

这是由于含尿素、盐酸胍的蛋白变性液对包涵体蛋白的结构及其动力学过程存在差异。

如图1所示，脲素和盐酸胍与蛋白质的结合度依赖于其浓度大小[5]。

图1:

尿素（◆）和盐酸胍（□）与氧化溶菌酶的结合[5]

本实验所用的溶菌酶含有一对完整的二硫键结构。

当二硫键减少（例如在包涵体中），尿素或盐酸胍就会与其产生强的结合力。

结合度是通过平衡透析的方法来测定（T.ArakawaandS.N.Timasheff（未出版）。

通常情况下，浓度为6～8M的尿素和6～7M的盐酸胍可以实现蛋白质的溶解。

然而，即使在浓度最高的情况下，蛋白质分子内和分子间发生的相互作用往往也可导致非天然结构的形成,如图2所示。

这些非天然的结构可导致聚合物的形成或去变性剂后导致其错误折叠。

在含有一定浓度变性剂的非天然结构蛋白溶液中,只要分子的相互作用条件更有利于天然结构的形成,则含有二硫键的蛋白质就可以形成天然的二硫键结构。

在变性剂含量降为中等浓度时（如图1所示）,其（尿素和盐酸胍）与蛋白质的结合力也降低，因此，蛋白质分子开始重新折叠。

因此，它有可能通过调节盐酸胍和尿素的浓度来调节其与蛋白的结合力，来提高蛋白的复性效率。

这种情况不包括洗涤剂在内。

洗涤剂与蛋白的结合力决定于其临界胶团浓度（CMC）的大小。

这种胶团结合往往在临界胶团浓度之上，即变性非折叠蛋白溶解性好的条件下发生,而这种胶团结合不能或者很少能在临界胶团浓度之下,即蛋白溶解性差的条件下发生[6]。

分子间的相互作用

内部分子间的相互作用

天然构象

图2：

非天然结构中分子内与分子间的相互作用[6]

图中所示（图上）,天然状态模型的蛋白质有相互作用的螺旋结构（A和B）和彼此间隔较远的疏水区（C和D）。

这种螺旋结构的相互作用在非折叠状态时即消除，而非折叠状态下分子内部（图中右）及分子间（图中下）发生疏水区C和D之间的疏水相互作用。

这表明，只有在洗涤剂存在的条件下，蛋白复性过程才能发生，否则，去除洗涤剂后，蛋白质结构和溶解度又将形成原包涵体。

2.蛋白复性

复性过程是蛋白质构象从展开状态到折叠状态的变化过程。

包涵体只能由强变性剂溶解，使其蛋白质成展开状态，其溶解程度主要取决于蛋白质本身及其所使用的变性剂类型。

包涵体经过变性剂溶解后的蛋白质为高度可溶性。

与纯化的蛋白复性研究不同，包涵体溶解蛋白含有蛋白表达系统产生的杂质，其可能干扰蛋白质的复性。

因此，为了减少杂质对复性过程的干扰,可以先对该蛋白质进行纯化。

如图3所示，复性过程是蛋白质构象从展开状态到折叠状态的的变化过程。

在高浓度变性剂条件下，蛋白质呈展开（无序）状态，高灵活性及高溶解性。

在复性缓冲溶液中，蛋白质呈有序折叠状态，为刚性好，结构紧凑的构象。

在理想的情况下，蛋白质分子从高浓度变性剂到复性缓冲溶液将使蛋白质复性，即蛋白质分子将有序折叠成为紧凑的结构。

然而，这样一个剧烈的过程通常很难发生，因为条件的剧烈变化会导致其分子的错误折叠和聚集。

一旦蛋白分子错误折叠或聚集，在没有变性剂存在的条件下，蛋白分子将不可能自行解聚以及重新折叠成天然构象。

如图3所示，复性的关键在变性剂合适的浓度，当变性剂浓度足够低时，以迫使蛋白质分子解聚，并且解聚的蛋白分子溶液可以重新折叠为有序构象。

蛋白复性过程中变性剂的最适浓度主要取决于蛋白质以及变性剂浓度的减少方式。

天然构象

折叠度

折叠状态：

刚性好，结构紧凑的构象

展开状态：

无序性、高灵活性、高溶解性

变性剂浓度

中间构象

图3：

变性剂浓度对蛋白质的构象，灵活性，和溶解度的影响

以折叠程度为纵坐标，以变性剂浓度为横坐标作图。

蛋白质溶液的物理性质主要在变性剂浓度的高低。

平衡展开研究已经证明了在变性剂条件下,当变性剂浓度为某一浓度时会产生中间体结构（图4：

I）。

如图4所示,在复性过程中也会有这样的中间结构产生。

但该中间结构不稳定且不易溶解，因此很容易产生错误折叠和聚集。

因此,为了保持中间体的溶解性和灵活性，使中间体更加有效折叠成更稳定的天然结构（N）显得尤为重要。

在蛋白质复性过程中,蛋白是直接折叠为有活性构象还是经过中间结构再折叠为活性构象主要取决于对变性剂浓度的减少及小分子添加剂的添加量。

图4：

复性过程示意图。

其中，U、I、N分别对应蛋白展开状态，中间结构和蛋白质有序折叠的天然状态

含有二硫键的蛋白质即使在高浓度变性剂存在条件下也可以发生图5所示的构象的重新折叠。

也就是说，该种条件下蛋白质分子仍然可以在展开状态和天然构象结构之间变化，并能形成天然的二硫键结构[U（SS）]。

然而，在高浓度变性剂条件下天然二硫键形成的速率及概率大大降低。

图5所示,无论是A组两种构象的转换还是B组三种构象的转变，在低浓度变性剂条件下都会加速蛋白质二硫键的形成。

虽然低浓度变性剂将增加复性效率，但可能会迫使蛋白质错误折叠成非天然二硫键结构。

一旦形成非天然二硫键结构，由于变性剂浓度太低，蛋白质构象不能重组，从而无法重新折叠为天然结构。

图5：

蛋白折叠与二硫键的形成。

A与B分别表示了二硫键的形成以及构象变化过程

天然二硫键是在一定的变性剂条件下形成，因此不能保证其天然构象的形成是通过移除变性剂来实现的。

在天然二硫键的形成过程中，仍然有很大一部分蛋白质是展开状态，而且变性剂突然去除可能会导致错误构象的形成。

因此，变性剂被去除的方式，可以影响复性效率。

下面我们讨论的是洗涤剂的作用差异性。

如图6所示，洗涤剂与分子的胶团结合往往在临界胶团浓度之上发生，在临界胶团浓度之下为单分子之间的单一结合。

在单分子间的结合条件下蛋白质极度不溶，而在洗涤剂与分子胶团结合条件下蛋白质为高度溶解[7]。

图6：

强浓度洗涤剂N-月桂酰肌氨酸在临界胶团浓度之上时发生洗涤剂与分子的胶团结合，在临界胶团浓度之下则发生分子间的单分子结合[7]

由于没有中间结构的形成，所以当蛋白质溶解在洗涤剂混合液中时没有二硫化物形成，因此不能通过降低洗涤剂浓度至临界胶团浓度之下来诱导折叠。

复性，是一个由蛋白结构的中间体结构与活性和非活性结构之间的动态平衡过程，天然结构与错误折叠或蛋白聚集之间竞争。

因此，最佳复性一方面要求变性蛋白崩溃而进行重新折叠，另一方面维持分子的溶解度和灵活性。

这种平衡可以通过由两个不同的手段来实现。

其一是变性剂浓度的减少方式。

无论是是透析或稀释，任何过程都必须经过最佳适宜的变性浓度。

变性剂移除的速率快慢与蛋白分子在适度变性浓度中存在的时间长短都决定了蛋白的折叠率和折叠中间体的灵活性、溶解度。

此外，对其蛋白的正确折叠与错误折叠或聚集速率可以通过小分子添加剂进行控制。

小分子添加剂，可以提高蛋白灵活性或溶解度。

以下，我们分别描述了这两个参数，但在复性过程中，应结合这两个参数寻求最佳优化条件。

首先，我们讨论减少变性浓度的各种方式。

2.1一步透析复性

在一定浓度的变性溶液中，变性蛋白样品在复性缓冲液中透析，从而达到降低变性剂浓度的目的。

如图7-A所示，随着时间增加变性剂浓度逐渐减少，最后达到复性溶剂浓度。

随着变性剂的浓度降低，折叠为到中间体和天然构象的速率增加。

但同时错误折叠和蛋白聚集的速率也相应增大。

特别是，由于变性剂从中浓度到低浓度变化过程中不足以维持展开状态或不足以使中间体维持溶解状态，因此，如果在该过程中折叠速率太低，蛋白聚合将会大大增强。

在透析复性时，中间体结构可能会长期暴露于中间浓度变性剂中。

此方法对处理在展开状态或中间体可溶的蛋白质成功几率更大。

需要指出的是,虽然变性剂浓度降低，但由于盐酸胍或尿素的高渗透压，溶液体积会膨胀，从而使蛋白质浓度保持相对恒定。

这意味着，在变性剂中蛋白的初始浓度是至关重要的。

2.2分步透析复性

该透析方法来降低变性剂浓度已成功应用于抗体蛋白的复性[8,9]。

如图7B-1所示，首先将伸展状态的蛋白样品置于高浓度变性剂溶液中，然后置于中等浓度的变性剂缓冲液中（7B-2），最后置于低浓度变性剂缓冲液中（7B-3）。

其与一步透析的区别在于每个变性剂浓度平衡的建立。

然而，如图8所示，如果错误折叠或聚集率（kmis/agg）高于复性速率（kref）。

那么这种方法将不起作用。

但该方法有一个好处就是错误折叠或聚集的中间体在中间浓度的变性剂存在的条件下，可以重新进行复性，尤其是在一些含有二硫键的氧化型与还原型二硫结构的相互转换过程中。

在每个变性剂的浓度，折叠中间体都可能形成错误折叠或聚合。

然而，中间浓度的变性剂可能会使蛋白分子转换为含有正确二硫键结构的天然构象。

在高浓度变性剂平衡液中可能折叠为最稳定结构域。

可能这个特殊的领域在高浓度变性剂环境下较低浓度更有利于其存在，同时在一步透析方法中，这种结构域不稳定，在复性中可能会导致错误折叠。

复性剂

泵

图7：

透析复性。

A组：

透析过程中变性剂浓度的变化。

B组：

从高浓度的变性剂

（1），通过中间浓度

（2），到低浓度（3）分步进行透析。

C组：

在透析过程中，在透析袋中的变性蛋白在高变性剂浓度的溶剂中平衡。

逐渐抽入复性缓冲溶剂，同时将透析液逐渐抽出。

在复性透析过程中，变性剂浓度的溶剂将逐渐降低[10]

2.3梯度递减变性剂浓度透析

如图7-C所示，为变性剂浓度递减的一步透析法[10]。

在高浓度变性剂中的变性蛋白装入透析袋后置于变性剂溶液中，将透析液逐渐抽出，同时逐渐抽入复性缓冲液，透析过程中溶剂的泵出速率和复性液的泵入速率决定了变性剂浓度梯度减少。

如果速度太快，它将类似于一步透析法，如果速度缓慢，它又类似于多步透析法。

聚集抑制剂

折叠增强剂

错误折叠

聚集

图8：

折叠和聚集。

参数kref，kmis/Agg，Kex，分别表示复性率从I到N的复性速率，错误折叠或聚集速率，从错误折叠或聚合体到I中间体的反应速率，当错误聚集抑制剂减少了从I到错误折叠或聚集体形成速率时，折叠增强剂便能增强U到I和I到U的反应

2.4凝胶过滤交换法

凝胶过滤柱在复性缓冲液中平衡。

将变性液中的展开状态的蛋白质上柱，用复性缓冲液进行洗脱。

使用脱盐柱将使蛋白质与变性剂分离，而使用按蛋白质大小分离柱将分离得到不同片段大小的蛋白质。

在一次透析复性过程中，变性剂浓度逐渐递减，同样，在凝胶过滤法中变性剂浓度也逐渐减少。

如果展开结构或中间折叠结构转换为天然结构的速率慢于转换为错误折叠或聚集体的速率，那么随着变性剂浓度的逐渐降低错误折叠构象将没有足够的时间转换为天然结构。

另外，长时间暴露在中间变性浓度可能会导致蛋白质聚集或错误折叠。

与透析的区别在于在其蛋白在折叠过程中柱模型所处的环境不同。

在能够防止蛋白错误折叠与聚集的中间变性剂浓度下的蛋白折叠过程中，凝胶柱可能通过氢键和疏水作用与蛋白相互作用。

而且柱模型可以使蛋白分散，有效减少了蛋白聚集。

该方法已经成功应用于盐酸胍溶解的人白介素-6（IL-6）的复性[11]。

在这种情况下，溶解于盐酸胍中的IL-6首先被氧化形成正确的二硫键，然后通过G-25凝胶过滤柱在复性缓冲液平衡进行蛋白复性。

这也证明正确二硫键的形成是复性的前提条件，但对IL-6来说还形成正确的二硫键还不足以成功复性。

即使形成正确的二硫键后，优化盐酸胍去除方法对于天然结构的形成也是非常必要的。

2.5稀释法复性

高变性剂浓度蛋白质样品加入到大量的复性缓冲液中。

稀释法没有经过中间变性剂浓度，因此展开蛋白在稀释过程中会迅速崩溃。

所以，在稀释复性过程中有几个参数需要考虑。

首先，如图9所示，在正常稀释法中，将在变性剂中的展开蛋白加入到复性液中时，蛋白质浓度与变性剂浓度都在增加，例如将6M盐酸胍溶解的蛋白质溶液加入到复性缓冲液中稀释6倍后，复性缓冲液盐酸胍浓度从0M变为1M。

如果没有低浓度变性剂浓度的存在，稀释至缓冲溶液后将迅速崩溃形成一些刚性结构，而不再能进行结构的转变以及不能转换为天然结构。

因此，我们建议在最终应该含有一定浓度的变性剂，浓度的大小主要取决于蛋白复性后的稳定性。

第二，对于低聚蛋白，在稀释复性的早期阶段，变性剂浓度几乎为0，蛋白质浓度较低。

因此，缓慢稀释可能导致变性剂浓度与蛋白浓度的不足而不能进行很好的复性，蛋白会以较长时间的单体状态存在，因此，建议用快速稀释法。

第三，如果为了避免蛋白的聚集要求以较低浓度，脉冲稀释法可能更适用。

终浓度

反稀释法

图9：

稀释复性。

左边组中为一般稀释法。

右侧组为反稀释法

2.6反稀释法复性

反向稀释是将复性缓冲液加入到含有一定浓度变性剂的展开状态蛋白质溶液中，该情况下无论是变性剂和蛋白的浓度，都同时降低（图9：

反向稀释）。

与稀释法不同，在中间浓度变性剂中蛋白质浓度较高。

这样的条件下会导致蛋白的聚集和沉淀。

然而，如果在中间的变性剂浓度的条件下，中间结构为可溶和复性需要缓慢的结构重排，这个方法可能比较适用。

混合法复性

复性缓冲液与展开蛋白溶液以一定比例进行混合。

该过程与稀释和反稀释不同，过程中，复性蛋白质和变性剂浓度保持不变。

与稀释复性过程的蛋白折叠过程类似的，即在，混合也将导致蛋白质迅速崩溃形成一种中间结构。

未折叠蛋白

复性溶剂

收集容器

混合器

混合

图10：

混合复性。

未折叠蛋白和复性缓冲液混合。

例如，通过泵，以固定的比例混合。

在恒定的比例混合，折叠过程中变性剂和蛋白含量保持恒定

2.7脉冲稀释法复性

稀释被分为相同的几个阶段,而不是连续的模式。

在脉冲稀释中取变性蛋白质溶液平分为几组，每组加入至复性溶剂中开始复性，复性一定时间后再加入相同的变性蛋白溶液继续进行复性。

该方法将有效避免在一步稀释复性中出现的高浓度的折叠中间体的聚集。

该方法可能使用于展开或折叠蛋白中间体不发生聚集时的复性。

2.8固相复性

图11所示，在变性剂存在的情况下，变性蛋白首先与固体基质（如镍树脂或离子交换树脂）以非共价结合。

然后变性剂浓度减少为初始复性液浓度。

由于蛋白质分子与树脂结合，该过程中减少了展开蛋白的聚集和折叠中间体的形成。

复性剂

变性剂

正确折叠

复性剂

错误折叠

图11：

柱复性。

在变性剂溶液中存在两种蛋白结合力。

在A类型中，展开蛋白与固体基质有两种结合力，一种为末端的His-tag，另一种为多肽末端的氨基酸残基。

这种多种的结合可能导致蛋白的错误折叠。

在B类型中，非折叠蛋白仅仅通过His-tag与固体基质进行结合，进行复性成为天然结构

如图11下面组所示，如果蛋白与固体基质以多价结合，蛋白质分子则不能进行蛋白的折叠过程。

即使是单价结合，由于空间位阻或重要蛋白分子的结合位点，折叠可能会受到干扰。

为了克服这个问题，复性进行下弱游离的条件下即蛋白可以与树脂进行可逆性结合条件下进行。

3小分子物质助溶

小分子物质（溶质）通常被添加到复性溶剂中，以协助蛋白折叠。

在一般情况下，特别是通过稀释复性，复性溶剂中均含有低浓度的尿素或盐酸胍。

这个浓度是足够低，以能保持高效复性，但高到足以维持折叠中间体的溶解度和灵活性。

然而，仅有尿素或盐酸胍是不够的，共同的溶质往往是必不可少的。

没有该小分子的存在，复性会产生不同程度的聚合或错误折叠。

这种小分子物质可分为两种，一种为增强折叠，另一种为抑制聚集，见表1所示。

表1：

小分子添加物的分类

分类

溶质-作用模式

蛋白稳定性的影响

蛋白内部相互作用的影响

折叠增强剂

蔗糖

硫酸铵

稳定性好

增强

聚集抑制剂

精氨酸

温和洗洁剂

稳定性适中

减小

变性剂

尿素

盐酸胍

强烈洗洁剂

不稳定

减小

图8示意图很好的描述了小分子对该过程额影响。

而这两种作用可能具有相互的排斥性，因为折叠的增强原则上增强了蛋白质之间的相互作用，而聚集的抑制则降低了蛋白之间的的相互作用。

聚集的抑制减少了折叠中间体的结合而不影响复性过程的进行。

它包括聚乙二醇[12]，环糊精[13]，精氨酸盐酸[14,15]，脯氨酸[16-18]。

与聚乙二醇和环糊精结合的折叠中间体为疏水区域。

在这些小分子物质中，精氨酸是最常用的。

然而，目前尚不清楚精氨酸如何降低折叠中间体的聚集。

但它对蛋白质稳定性的影响已经很明确[19,20]。

精氨酸既不是一种蛋白质稳定剂，也不增强蛋白的折叠。

有许多极性小分子添加剂，可以提高蛋白质的稳定性，并能在体内增强蛋白质的折叠。

这些包括糖，多元醇，某些盐类，如硫酸铵和氯化镁，和某些氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸。

虽然这将提高蛋白质折叠成一个紧凑的结构，他们也可增强错误折叠和聚合。

这些错误的结构可能是过于紧凑和刚性，无法使错误折叠的结构重新折叠为天然结构。

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