慢病毒包装浓缩纯化滴度实验步骤.docx

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慢病毒包装浓缩纯化滴度实验步骤

一、包装细胞293T细胞的培养

一、293T细胞的冻存

1.随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。

所以要在细胞购进时就进行冻存。

2.在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3.倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。

4.加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。

5.镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

6.细胞计数。

7.将细胞离心，1000rpm，2min。

8.根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。

10.第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

二、293T细胞的传代

1.当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

2.消化细胞，方法同上。

3.细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。

密度为3×105个/ml。

4.分到10cm培养皿中，10ml/皿。

三、293T细胞的复苏

1.当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2.打开水浴锅，设置温度为40℃。

3.查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2min内使细胞溶液完全溶解。

4.将1ml细胞溶液加入9ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

5.放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

6.第二天观察细胞存活率。

倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。

二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定

1.所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下

5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3'（forwardprimer）,

5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3'（reverseprimer）and

5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3'（probe）

2.TaqManUniversalPCRMasterMix（AppliedBiosystems，cat.no.4304437）

3.TaqManDNATemplateReagentKit（AppliedBiosystems，cat.no.401970）

4.TaqManRNasePcontrolreagent（AppliedBiosystems，cat.no.4316844）

用于包装的293T细胞的培养

用于包装的293T细胞（ATCCNo.CRL-11268）必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。

任何时候细胞汇合率都不准达到100%。

慢病毒的包装

1.预先准备3个T150瓶的293T细胞，培养基为DMEM+10%FBS，1%Glutamax，1%青霉素-链霉素。

2.将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是8×106个。

3.第二天，镜下检查细胞。

细胞融合度应大致为30-40%，分布均匀。

4.转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。

5.取两支无菌的50ml离心管，其中一支中加入252μgpNL-EGFP/CMV/WPREDU3载体质粒，168μgpCD/NL-BH*DDD包装质粒和84μgpLTR-G质粒，用Opti-MEM培养基补齐到18ml。

另一支中加入500μlTrans-EZ溶液和17.5mlOpti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。

将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。

关键步骤：

推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。

6.室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。

7.取1支5ml的移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板3ml。

来回晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。

每一皿细胞培养盘不要超过6盘。

8.6小时后，移去细胞上清，更换为17ml的DMEM完全培养基。

9.转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近60-80%。

如果所转染质粒带有GFP荧光，那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。

10.将细胞送回培养箱继续培养2天（36-48小时）。

在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。

11.收集所有的上清，分装到50ml离心管中。

12.4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。

13.总的上清约为204ml，用250-ml0.45μmPVDF过滤装置过滤。

如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。

慢病毒的浓缩与纯化

方法一超速离心沉淀法

1.取6个Ultra-clearSW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。

2.每个Ultra-clearSW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。

3.取一支10ml的移液管，吸取12ml20%的蔗糖溶液。

将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4ml。

同样地，将剩下8ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。

另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。

4.用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。

5.按次序将所有6个离心管放入BeckmanSW28超速离心转头中。

7.小心将管子从转头中取出。

倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。

吸掉剩余的液滴。

在管底应当有可见的沉淀。

8.每管中加入100ml不含钙和镁的PBS洗下沉淀。

9.将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

10.在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

11.4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

12.用200μl移液器轻柔吹打使沉淀重悬。

避免产生泡沫。

将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。

13.集中后的病毒悬液分装成50μl每份，保存在成品管中。

用碎干冰速冻后储存在-80℃。

方法二PEG-8000浓缩法

PEG（聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离，使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起，病毒的相对浓度提高，达到沉淀浓缩的目的。

5XPEG8000+NaCl配制称取NaCl8.766g;PEG800050g溶解在200mlMilli-Q纯水中；121摄氏度30min湿热灭绝30min；保存在4℃。

1.使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；

3.每20～30min混合一次，共进行3-5次；

4.4度放置过夜；

5.4度，4000g，离心20min；

6.吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；

7.加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；

8.集中后的病毒悬液分装成50μl每份，保存在成品管中。

用碎干冰速冻后储存在-80℃

病毒滴度的测定

稀释计数法

滴度单位：

TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。

”TU”为”transducingunits”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

第一天细胞准备

将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，为每个病毒准备10个孔。

放入37℃，5%CO2培养箱中培养。

第二天加病毒

在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。

稀释方法如下：

每种病毒准备10个1.5mlEP管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。

依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。

吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。

并做好标记。

第三天追加培养液

在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长。

第五天观察结果并计算滴度

在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。

假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y*10）*1000/2/X孔的病毒液的含量（μl）。

定量PCR法

病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。

每孔细胞为5×104个。

接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。

弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/mlpolybrene的新鲜培养基。

将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。

在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl和50μl的稀释病毒。

感染开始后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI（TakaraMirusBio，终浓度为10U/ml）的新鲜培养基。

在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。

然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。

用0.5ml0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。

用培养基吹洗下，离心收集细胞。

按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。

每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA。

用DNA定量试剂盒定量（Bio-Rad）。

基因组DNA可以稳定保存在-20℃至少2个月。

准备PCR所需的试剂和样品。

为病毒序列检测引物配总管Ⅰ：

2×TaqManMasterMix

25μl×n 

Forwardprimer（100pmolml-1）

0.1μl×n

Reverseprimer（100pmolml-1）

0.1μl×n

Probe（100pmolml-1）

0.1μl×n 

H2O 

19.7μl×n 

n=numberofreactions.例如：

总反应数为40，将1ml2×TaqManUniversalPCRMasterMix，4μlforwardprimer，4μlreverseprimer，4μlprobe和788μlH2O混和。

震荡后放在冰上。

为人基因组序列检测引物配总管Ⅱ：

2×TaqManMasterMix

25μl×n 

10×RNasePprimer/probemix

2.5μl×n 

H2O 

17.5μl×n 

n=numberofreactions.例如：

总反应数为40，将1ml2×TaqManUniversalPCRMasterMix，100μl10×RNasePprimer/probemix和700μlH2O混和。

震荡后放在冰上。

在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。

从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。

分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中，每个样品重复1次。

另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照（no-templatecontrol）。

分别取5μl基因组标准品和待测样品基因组DNA加入到E-G行中，每个样品重复1次。

另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照（no-templatecontrol）。

所使用定量PCR仪为ABIPRISM7000定量系统。

循环条