第二章 生产菌种的选育.docx

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第二章生产菌种的选育

第二章生产菌种的选育

工业化菌种的要求

❑能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物

❑有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强

❑遗传性能要相对稳定

❑不易感染它种微生物或噬菌体

❑产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）

❑生产特性要符合工艺要求

生产菌种的育种方法

第一节工业微生物的分离筛选（Separationandscreening）

一、菌种的来源

}根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；

}从大自然中分离筛选新的微生物菌种。

二、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤

从自然界中分离筛选菌种的目的是高效地获取一株高产目的产物的微生物。

具体步骤如下：

1.采样：

有针对性地采集样；

2.富集培养：

让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能；

3.纯种分离：

纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落；

4.菌落的选择：

利用筛选模型，选择具有目的产物合成能力相对高的菌株；

5.生产性能测定：

测定代谢产物或其它目的性状。

采样

1、采样对象

以采集土壤为主。

根据微生物营养类型。

根据微生物的生理特性。

极端环境条件下。

}2、采样季节：

以温度适中，雨量不多的秋初为好。

}3、采土方式：

在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。

为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。

富集方法（enrichement）

物理方法：

加热、膜过滤等

等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。

纯种分离

1．稀释分离法

2．平板划线分离法

⑴涂菌：

⑵划线分离：

菌株分离（seperation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需的微生物的过程。

菌落的筛选-筛选依据

菌落的筛选方法——分初筛和复筛

}初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。

如菌落直接涂布法

}复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。

因此在具体方法上就有差异。

}一般是将初筛菌株接入液体培养，当目的产物达到高峰时期，终止培养，用精确的检测手段，进行目的产物的定量测定。

}变色圈法:

例糖苷酶抑制剂产生菌的筛选，该模型是将放线菌发酵液浸润的小圆纸片，置于能产生糖苷酶而利用淀粉的酵母琼脂平板上，培养过夜后，平板培养基中的淀粉被酵母利用，当向平板中注入碘液时，如果在纸片周围出现蓝色的显色圈，说明纸片上存在糖苷酶抑制剂，抑制了淀粉的水解，并可根据显色圈的大小判断菌株产生的该抑制剂的活性高低。

}透明圈法:

在平板培养基中加入溶解性较差的底物,使培养基浑浊,能分解底物的微生物便会在菌落周围形成透明圈。

}例.-淀粉酶的筛选

}将适当稀释的样品，涂布在以淀粉为碳源的培养基上，生长后可见水解圈，碘染色后水解圈更清晰可见，根据圈的大小，选择菌落。

}抑菌圈法：

抗生素的筛选。

工具菌采用抗生素敏感菌，将待筛选菌涂布于（或用纸片浸润发酵液贴于）含有工具菌的平板上，若待筛选菌能分泌抗菌物质，在菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。

}浓度梯度法

}产物合成能力与抗自身产物能力有关

}有毒物质的降解能力与抗此毒物能力有关

}

}第二节工业微生物的诱变育种

}

}

}自然选育在工业生产上的意义

}自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。

}纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量

（一）诱变育种的一般步骤

出发菌株

同步培养

使菌细胞处于相同或接近的生理状态，一般为对数生长期

单细胞（或单孢子）菌悬液的制备

酵母或霉菌孢子106/ml

细菌108/ml

诱变剂的选择及其剂量的确定

以致死率为90％～99％为宜

诱变处理

①物理诱变剂

②化学诱变剂

（二）、筛选的方法

代谢控制育种

}目的代谢产物大量累积

Ø人为打破自动调节，改变代谢流向

Ø减少或切断支路产物的形成

Ø提高细胞膜的通透性

}减少育种的盲目性

Ø初级代谢产物生产，成效显著

Ø次生代谢产物生产，效果不明显

营养缺陷型突变体的筛选及其应用

营养缺陷型突变体：

auxotroph

野生型菌株失去合成某种生长及代谢所需物质（生长因子）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长的突变株。

　营养缺陷型可以使发生障碍的前一步的中间代谢产物大量积累。

　营养缺陷型在生物合成中发生障碍，合成反应不能完成，可通限量过外加缺陷的营养物，克服生长障碍，使终产物不致于积累到引起反馈调节的浓度,解除了终产物反馈阻抑，而有利于中间产物或另一途径终产物的积累。

1筛选用培养基

⑴基本培养基：

凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基；常以‘[-]’表示；MM

⑵在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培养基，称为完全培养基，常用‘[+]’表示；CM

⑶在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种营养缺陷成分，以满足相应的营养缺陷型生长的培养基，称为补充培养基，补充培养基可按所加入营养成分相应地用‘[A]’、‘[B]’等来表示。

SM

2．营养缺陷型菌株筛选的一般方法

（1）诱变剂处理

（2）淘汰野生型菌株

①抗生素法

②菌丝过滤法

（3）检出营养缺陷型

（4）鉴定营养缺陷型

淘汰野生型

}抗生素法：

野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。

由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。

一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。

}菌丝过滤法：

对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。

检出缺陷型

}原理：

在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。

}具体方法：

影印法、点种法、夹层法、限量补充培养法

代谢调节控制育种例2

}抗牲突变株的选育

}芽孢杆菌属的许多种类是重要的酶制剂生产菌。

根据有关学者观察和动力学分析，产酶高峰和芽孢的形成有一定的关系。

一般培养到一定阶段后就会产生芽孢，芽孢数量达到高峰，就停止产酶．故如能延迟或不产生芽孢，酶的产量便可提高。

如蜡状芽孢杆菌产淀粉酶菌株，菌种选育时发现在抗利福平的突变型中往往有较多的无孢子突变株，把该菌用诱变剂处理，涂布在含利福平的干板培养基上，长出的菌落薄而透明（无芽孢突变型的特怔），镜捡或使用产生芽孢的培养基进行验证，结果得到的是无芽孢突变型。

淀粉酶产量以7倍高于亲株。

这也是一个药物抗性突变型应用的实例。

}是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，则可获得目的基因产物或表现出有益性状。

基因工程（geneengineering）常和以下名称混用:

⏹遗传工程（geneticengineering）;

⏹基因克隆（genecloning）;

⏹分子克隆（molecularcloning）;

⏹基因操作（genemanipulation）;

⏹重组DNA技术（recombinationDNAtechnique）

载体（vector）DNA

用于传递运载外源DNA序列进入宿主细胞的DNA分子

功能：

为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。

为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。

为目的基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。

理想载体的基本条件：

可转移性

合适的复制位点

多克隆位点：

广泛、特异

选择标志，便于筛选和鉴定

分子较小，可容纳较大的外源DNA

载体的种类

质粒（plasmid）

噬菌体（phagemids）:

λ噬菌体、M13噬菌体

穿梭质粒（Shuttlevector）

柯斯质粒（Cosmidvector）

限制性内切酶（restrictionendonuclease）是存在于微生物细胞内用于分解外源DNA的一种酶。

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