理学细胞生物学第三章习题.docx

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理学细胞生物学第三章习题

本章习题

一．名词解释

1．分辨率（resolution）

分辨率是指能分辨出的相邻两个物点间最小距离的能力，这种距离称为分辨距离。

分辨距离越小，分辨率越高。

一般规定∶显微镜或人眼在25cm明视距离处，能清楚地分辨被检物体细微结构最小间隔的能力，称为分辨率。

人眼的分辨率是100μm;光学显微镜的最大分辨率是0.2μm。

2.荧光（fluorescence）

分子由激发态回到基态时，由于电子跃迁而由被激发分子发射的光。

物质经过紫外线照射后发出荧光的现象可分为两种情况，第一种是自发荧光，如叶绿素、血红素等经紫外线照射后，能发出红色的荧光，称为自发荧光;第二种是诱发荧光，即物体经荧光染料染色后再通过紫外线照射发出荧光，称为诱发荧光。

3.荧光显微镜（Fluorescencemicroscope）

以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。

荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。

4.相差显微镜（Phasecontrastmicroscope）

相差显微镜是荷兰科学家Zermike于1935年发明的，用于观察未染色标本的显微镜。

活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化（振幅差），这种振幅差人眼无法观察。

而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。

相差显微镜和普通显微镜的区别是:

用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。

相差显微镜具有两个其他显微镜所不具有的功能:

①将直射的光（视野中背景光）与经物体衍射的光分开;②将大约一半的波长从相位中除去，使之不能发生相互作用，从而引起强度的变化。

5.放射自显影（autoradiography）

放射自显影的原理是利用放射性同位素所发射出来的带电离子（α或β粒子）作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，这种潜影可用显影液显示，成为可见的"像"，因此，它是利用卤化银乳胶显像检查和测量放射性的一种方法。

放射性核素的原子不断衰变，当衰变掉一半时所需要的时间称为半衰期。

各种放射性核素的半衰期长短不同（表），在自显影实验中多选用半衰期较长者。

对于半衰期较短的核素，应选用较快的样品制备方法，所用剂量也应加大。

表自显影实验中常用核素的半衰期与能量

名称半寿期粒子类型能量（MeV）名称半寿期粒子类型能量（MeV）

3H12.3yrβ0.01845Ca152dβ0.26

11C20minβ0.98159Fe45dβ0.46

14C5700yrβ0.155γ1.30

32P14.3dβ1.7160Co5.3yrβ0.308

35S87.2dβ0.16764Cu12.8hrβ0.657

131I8.0dβ0.25　　γ1.35

6.扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscopy，SEM）

扫描电子显微镜是1965年发明的较现代的细胞生物学研究工具，主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射。

二次电子能够产生样品表面放大的形貌像，这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即使用逐点成像的方法获得放大像。

7.扫描透射电子显微镜（scanningtransmissionelectronmicroscopy，STEM）

既有透射电子显微镜又有扫描电子显微镜的显微镜。

象SEM一样，STEM用电子束在样品的表面扫描，但又象TEM，通过电子穿透样品成像。

STEM能够获得TEM所不能获得的一些关于样品的特殊信息。

STEM技术要求较高，要非常高的真空度，并且电子学系统比TEM和SEM都要复杂。

8.高压电子显微镜（high-voltageelectronmicroscopy，HVEM）

同透射电子显微镜基本相同，只是电压特别高。

TEM使用的加速电压是50～100kV，而HVEM使用的电压是200～1000kV。

由于电压高，就会大大减少造成染色体畸变的可能，因此，可以用较厚的细胞切片研究细胞的结构，切片的厚度最大可达1μm，相当于普通TEM样品厚度的10倍。

9.负染色（negativestainning）

用重金属盐（如磷钨酸钠、醋酸铀等）对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。

由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差，这样，在图像中背景是黑暗的，而未被包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染技术。

负染色是只染背景而不染样品，与光学显微镜样品的染色正好相反。

10.铸型技术（shadowcasting）

铸型技术是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法。

基本过程包括:

①将样品置于云母的表面，然后干燥;②在真空装置中将样品镀上一层重金属（金或铂金），喷镀时的加热丝具有一定的角度;③将样品镀上一层碳原子，以增加铸型的强度和稳定性;④将铸型置于酸池中，破坏样品，只留下金属铸型;⑤将铸型漂洗后置于载网上进行电子显微镜观察。

11.冰冻断裂复型（freeze-fracturereplication）技术

先将生物样品在液氮中（-196℃）进行快速冷冻，防止形成冰晶。

然后将冷冻的样品迅速转移到冷冻装置中，并迅速抽成真空。

在真空条件下，用冰刀横切冰冻样品，使样品内层被分开露出两个表面。

如用冰刀切开细胞膜时，分开的两个面分别称为P面（protoplasmicface）和E面（exoplasmicface），P面是靠近细胞质一面的半层膜，而E面则是靠近细胞外基质面的半层膜，可清楚地观察到镶嵌蛋白。

12.冰冻蚀刻（freeze-etching）技术

是在冰冻断裂技术的基础上发展起来的更复杂的复型技术。

如果将冰冻断裂的样品的温度稍微升高，让样品中的冰在真空中升华，而在表面上浮雕出细胞膜的超微结构。

当大量的冰升华之后，对浮雕表面进行铂-碳复型，并在腐蚀性溶液中除去生物材料，复型经重蒸水多次清洗后，置于载网上作电镜观察。

13.扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope，STM）

扫描隧道显微镜使用电子学的方法，用一个金属针尖在在样品表面扫描。

当针尖和样品表面距离很近时（1nm以下），针尖和样品表面之间会产生电压。

当针尖沿X和Y方向在样品表面扫描时，就会在针尖和样品表面第一层电子之间产生电子隧道。

该显微镜设计的沿Z字形扫描，可保持电流的恒定。

因此，针尖的移动是隧道电流的作用，并且可以反映在荧光幕上。

连续的扫描可以建立起原子级分辨率的表面像。

与电子显微镜或X线衍射技术研究生物结构相比，扫描隧道显微镜具有以下特点∶

①高分辨率扫描隧道显微镜具有原子级的空间分辨率，其横向空间分辨率为lÅ，纵向分辨率达0.1Å，

②扫描隧道显微镜可直接探测样品的表面结构，可绘出立体三维结构图像。

③扫描隧道显微镜可在真空、常压、空气、甚至溶液中探测物质的结构。

由于没有高能电子束，对表面没有破坏作用（如辐射，热损伤等）所以能对生理状态下生物大分子和活细胞膜表面的结构进行研究，样品不会受到损伤而保持完好。

④扫描隧道显微镜的扫描速度快，获取数据的时间短，成像也快，有可能开展生命过程的动力学研究。

⑤不需任何透镜，体积小，有人称之为"口袋显微镜"（pocketmicroscope）。

14.酶细胞化学技术（enzymecytochemistry）

将细胞内的酶与底物相互作用，再将酶反应的产物作为反应物质，在酶的作用部位进行捕捉，使其在显微镜下具有可见性。

这种在酶作用下产生反应产物，经捕捉反应来间接证明酶定位的反应称为酶的细胞化学反应。

酶的细胞化学反应包括两个反应:

第一反应是酶作用于底物的反应，称酶反应，形成的产物称为初级反应产物;第二反应是捕捉剂与初级反应产物的作用，称捕捉反应，产生最终反应产物：

15.免疫荧光技术（immunofluorescence）

将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。

由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。

16.免疫电镜（immunoelectronmicroscopy）

将抗体进行特殊标记后用电子显微镜观察免疫反应的结果。

根据标记方法的不同，分为免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术和免疫胶体金技术。

如免疫铁蛋白技术是将含铁蛋白通过一种低分子量的双功能试剂与抗体结合，成为一种双分子复合物，它既保留抗体的免疫活性，又具有电镜下可见的高电子密度铁离子核心，因此用铁蛋白标记的抗体可通过电镜免疫化学的方法在电镜下定位细胞中的抗原。

由于某些固定技术（如锇酸固定）对抗体抗原的结合有干扰，因此应采取较为温和的样品制备方法。

17.染色体分选（chromosomesorting）

用流式细胞计分选特定的染色体，基本过程与细胞分选相似。

不同的是，要用带有荧光标记的DNA探针同特异染色体结合，使待分选的染色体带上标记。

在染色体分选中，使用的探针是同所感兴趣染色体互补的寡聚核苷酸，这种探针也可同荧光染料偶联。

将结合有荧光染料的探针同染色体一起温育，使探针同特异染色体杂交，形成稳定的杂交体，这样染色体就被带上了荧光标记，稀释后送入流式细胞计的流室，然后与细胞分选过程一样将特异的染色体分选出来。

18.显微分光光度术（microspectrophotometry）

将显微镜技术与分光光度计结合起来的技术。

它以物质分子的光吸收、荧光发射和光反射特性作为测定基础，可用来分析生物样品细微结构中的化学成分，同时进行定位、定性和定量。

19.显微荧光光度术（microfluorometry）

利用显微分光光度计对细胞内原有能发光的物质或对细胞内各种化学成分用不同的荧光经荧光探针标记后进行定位、定性和定量地测定，称为显微荧光光度术，也称细胞荧光光度术（cytofluorometry）。

它是一种微观而灵敏的方法，对于研究细胞的结构、功能及其变化具有重要意义。

20核磁共振技术（nuclearmagneticresonance，NMR）

核磁共振技术可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小（20，000道尔顿以下）的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。

核磁共振的基本原理是:

原子核有自旋运动，在恒定的磁场中，自旋的原子核将绕外加磁场作回旋转动，叫进动（precession）。

进动有一定的频率，它与所加磁场的强度成正比。

如在此基础上再加一个固定频率的电磁波，并调节外加磁场的强度，使进动频率与电磁波频率相同。

这时原子核进动与电磁波产生共振，叫核磁共振。

核磁共振时，原子核吸收电磁波的能量，记录下的吸收曲线就是核磁共振谱（NMR-spectrum）。

由于不同分子中原子核的化学环境不同，将会有不同的共振频率，产生不同的共振谱。

记录这种波谱即可判断该原子在分子中所处的位置及相对数目，用以进行定量分析及分子量的测定，并对有机化合物进行结构分析。

21.细胞工程技术（cellengineering）

细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。

包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。

主要内容包括：

细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养。

22.原代培养（primaryculture）

原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。

因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。

但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。

最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。

组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。

分散培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。

如欲从胎儿或新生儿的组织分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶（如胰蛋白酶和胶原酶）消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂（如EDTA）除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。

23.愈伤组织（callus，culli）

植物受创伤后，在伤面新生的组织称为愈伤组织。

其原因是由于受创伤的刺激后，伤面附近的生活组织恢复了分裂机能，加速增生而将伤面愈合。

在植物组织培养中的愈伤组织是指植物细胞在组织培养过程中形成的无一定结构的组织团块，在适宜的条件下，愈伤组织可再分化，形成芽、根，再生成植株。

24.细胞融合（cellfusion）

在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。

基本过程包括细胞融合形成异核体（heterokaryon）、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。

有性繁殖时发生的精卵结合是正常的细胞融合，即由两个配子融合形成一个新的的二倍体。

自发的动物细胞融合机率很低，1962年Okada和Tadokoro发现灭活的仙台病毒有促进细胞融合的作用。

这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。

病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。

此外，用聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）作为细胞融合剂，它可引起邻近的细胞膜的粘合，继而使细胞融合成为一个细胞。

25.单克隆抗体技术（monoclonalantibodytechnique）

1975年英国科学家Milstein和Kohler所发明，并获得1984年诺贝尔医学奖。

它是将产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖将杂种细胞，并以此生产抗体的技术。

其原理是:

B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。

将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。

26.显微操作术（micromanipulation）

在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的技术属显微操作技术。

显微操作仪是在显微镜下对细胞进行显微操作的装置，可用于细胞核移植、基因注入、染色体微切和胚胎切割等手术。

27.差速离心（differentialcentrifugation）

主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。

起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。

收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。

28.移动区带离心（moving-zonecentrifugation）

这一方法需要用蔗糖或甘油制备轻微的连续密度，然后将待分离的样品加在离心管的最上层，形成一狭窄的带，再通过较长时间的离心。

在离心过程中，大小、形状、密度不同的颗粒就会分开，最后收集各区带得到要分离的物质。

在此方法中，分离介质对被分离的物质必须是中性无害的，并且密度梯度较低，底部的密度比管顶部的密度大，建立密度梯度的目的是防止扩散。

重要的是，待分离颗粒的密度比离心管中任何部分介质的密度都要大。

常用的是蔗糖密度梯度离心（sucrosedensitygradientcentrifugation）。

29.等密度离心（isodensitycentrifugation）

等密度离心分离样品主要是根据被分离样品的密度。

在这种离心分离方法中，要用介质产生一种密度梯度，这种密度梯度覆盖了待分离物质的密度，这样，通过离心使不同密度的颗粒悬浮到相应的介质密度区。

在这种梯度离心中，颗粒的密度是影响最终位置的惟一因素，因此用这种方法分离颗粒，主要是根据被分离颗粒的密度差异。

只要被分离颗粒间的密度差异大于1%就可用此法分离。

蔗糖或者甘油（它们的最大密度是1.3g/cm3）通常可用于分离膜结合的细胞器，如高尔基体、内质网、溶酶体和线粒体。

在等密度梯度离心中蔗糖或甘油的梯度的作用与移动区带离心中梯度原理是不同的，在移动区带离心中梯度的惟一目的是减少样品的扩散，即使是在离心管的底部，颗粒的密度也比介质大。

相反，在等密度梯度离心中，使用的密度是足以阻止颗粒移动的密度，当颗粒达到与本身密度相同的密度区时就会停留在该区域。

离心分离密度大于1.3g/cm3的样品，如DNA、RNA，需要使用密度比蔗糖和甘油大的介质。

重金属盐氯化铯（CsCl）是目前使用的最好的离心介质，它在离心场中可自行调节形成浓度梯度，并能保持稳定。

在氯化铯形成的密度梯度中，离心管顶部的密度为:

1.65g/cm3，底部为:

1.75g/cm3。

因为DNA的密度是1.70g/cm3，会停留在离心管的中部。

30.层析分离技术（chromatography）

根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。

各种不同的层析方法都涉及共同的基本特点:

有一个固定相和流动相，当蛋白质混合溶液（流动相）通过装有珠状或基质材料的管或柱（固定相）时，由于混合物中各组份在物理化学性质（如吸引力、溶解度、分子的形状与大小、分子的电荷性与亲和力）等方面的差异使各组分在两相间进行反复多次的分配而得以分开。

流动相的流动取决于引力和压力，而不需要电流。

用层析法可以纯化得到非变性的、天然状态的蛋白质。

层析的方法很多，其中凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等是目前最常用的层析方法。

31.凝胶过滤层析（gelfiltrationchromatography）

凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。

层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。

32.亲和层析（affinitychromatography）

将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。

那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。

在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。

生物分子间的这种结合能力称为亲和力。

亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。

33.基因工程（geneengineering）

基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因（DNA分子），按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

34.基因克隆（genecloning）

是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。

"分"是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；"切"是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；"选"则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。

基因工程技术的两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达，而分子水平上的操作即是体外重组的过程，实际上是利用工具酶对DNA分子进行"外科手术"。

35.基因敲除（geneknockout）

是指一个有功能的基因通过基因工程方法完全被剔除的人工突变技术。

人为的将小鼠的某一种有功能的基因完全缺失的技术就称为基因敲除技术。

这项技术是MarrioCapecchi于八十年代末在Utah大学发展起来的。

实验的动物通常是小鼠，被敲除了功能基因的小鼠就称为敲除小鼠（knockoutmice）。

基因敲除技术已成功地应用于几种遗传病的研究，还可用于研究特定基因的细胞生物学活性以及研究发育调控的基因作用等，因此是研究基因功能的一项非常有用的技术。

基因敲除是一套组合技术，包括基因重组、细胞分离培养、转基因等。

36.暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）是光学显微镜的一种，也叫超显微镜（ultramicroscope）。

暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）的聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。

利用这种显微镜能见到小至4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。

37干涉显微镜（interferencemicroscope）一种利用透过标本光束与参照光束在成像焦面合轴，造成干涉效应，观察半透明标本和测定折射率的显微镜。

38.倒置显微镜（invertedmicroscope）物镜置于镜台下方的光学显微镜。

适于培养细胞的显微观察和显微操作。

39.银染色silverimpregnation

是一种染色方法，即先将组织切片用硝酸银或氧化银浸渍，使银的氯化物、磷酸盐、尿酸盐等沉淀，水洗后，通过福尔马林、照相显影剂（氢醌）或日光的作用，使银还原，由于析出的金属银的作用而得到黑色的染色相。

用这种方法，银盐的还原是通过从细胞外加入的还原剂或日光来进行的，而来源于细胞的还原性物质与此无关。

根据这一点，可以将银染色与嗜银反应区别开来。

因此认为，银染色除用于检测氯离子以外，而作为组织化学反应的价值并不大，这是与组织的微细表面结构的状态有关。

银染色的机理虽不清楚，但很早以来则一直是神经组织形态观察的有力手段。

广义的银染色有时也包括嗜银反应

二．判断题

1.在使用光学显微镜时,如果物镜不变,用10X的目镜时的分辨率比用5X的高一倍。

2.CsCl密度梯度离心法分离纯化样品时,样品要和CsCl混匀后分装,离心时,样品中不同组分的重力不同,停留在不同区带。

3.提高显微镜的分辨率,可通过缩短波长,或给标本染色。

4.在光学显微镜下观察到的细胞结构,称为显微结构,在电子显微镜下观察到的结构称为亚显微结构或超微结构。

5.相差显微镜可用来观察活细胞和未经染色的标本。

参考答案：

1.答：

错，10X目镜比5X的目镜放大倍数高,但分辩率没有变；

2.答：

错，CsCl密度梯度离心法分离纯化样品是根据浮力而不是重力；

3.答：

错，染色只是增强反差,但不能提高分辩率；

4.答：

对，电子显微镜观察到的结构比光学显微镜观察的显微结构精细,故称为超微结构。

5.答：

对，相差显微镜通过相位差观察标本,故可不需染色。

三．选择题

1.通过选择性或克隆形式从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志的细胞群体称作（