蛋白质分离纯化试题版.docx
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蛋白质分离纯化试题版
一、已知某生物中一种蛋白质的分子量约为62000，请最大限度的分离纯化这种蛋白，根据下列要求写出具体的分离纯化方法。
（1）利用溶解度差别进行分离
（2）利用蛋白分子大小进行分离
（3）根据不同的电荷进行分离
（4）利用已制备对的抗体进行分离
（5）蛋白质纯度坚定
答：
（1）根据溶解度不同进行分离纯化
影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。
但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。
常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。
等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。
每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最低;相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。
因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。
（2）根据分子大小不同进行分离纯化
蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。
根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
（3）根据电荷不同进行分离纯化
根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。
在外电场的作用下,带电颗粒（如不处于等电点状态的蛋白质分子）将向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳。
聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。
它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。
离子交换层析（Ionexchangechromatography,IEC）是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。
带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。
离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。
（4）利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力（即生物学亲和力）建立起来的一种有效的纯化方法。
它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。
应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性,以便设计出最好的分离条件。
近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力[20]。
测定蛋白质纯度的5个方法
蛋白质分离纯化的最后一个步骤是鉴定蛋白质样品是否均匀一致。
但从目的蛋白质中检测出少量污染蛋白质远非易事，这是由于污染蛋白质的量可能低于其分析方法的检测极限，当用一种方法检验蛋白质纯度时，可能有两个或者更多的蛋白质表现行为类似，这种类似的表现行为可能会得出本来是混合物的样品却被认为是均一的错误结论。
因此，只用一种方法作为蛋白质纯度检验的标准不很可靠，纯度鉴定应采用多种分析方法，从不同角度测定蛋白质样品的均一性。
下面是几种鉴定纯度的方法。
1电泳法
电泳法是蛋白质纯度鉴定最常用的方法。
如果样品在凝胶电脓上显示一条区带，说明样品在其荷质比方面是均一的，可作为纯度鉴定酌一个指标。
如果在不同PH下电泳，出现一条区带，说明样品的分子旦是均一的，因此只适用于含有相同亚基的蛋白质。
2通过层析性质的检测
当样品用线性梯度离子交换层折或分子筛层析分离时，若得到的组分是均一的，则各分织组分的比活力应当恒定。
因此，可以通过层析组分具有相同的比活力，判定样品的层析性质是均一的。
3免疫化学法
免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳、放射免疫分析等都是鉴定蛋白质纯度的有效方法。
特别是放射免疫分析法发展迅速、应用广泛、几乎普及于生物体内各种微量成分的测定、灵敏度很高，但缺点是需要一定的设备。
4蛋白质化学结构分析法
随着蛋白质分析技术的改进，末端基团的测定方法等也逐渐用于蛋白质纯度的鉴定。
对于一个纯蛋白质来说，通过N一末端的定量分析可以发现，每摩尔蛋白质应当有整数摩尔的N末端氨基酸。
少量其它末端基的存在，常常表示存在着杂质。
如果只是定性地测定N末端，那么此法就只适用于仅有一个脸镊的蛋白质。
5超速离心沉降分析法
凝胶电泳可检测出占主要成分1%的杂质，但有些样品不适于用电泳法分析。
例如，脂蛋白和其膜束缚的蛋白质的电泳行为异常，而且其结构酌完整性需在去污剂存在下才能保持。
这时最好用超速离心法。
在离心管中若出现明显的分界线，或者分部取出离心管中的样品，管号对样品浓度作田，若组分的分布是对称的，则表明样品是均一的。
此法的优点是时间短，用旦少，缺点是灵敏度较差，微量杂质难以捡出。
总而言之，检验纯度的最常用方法是电泳法。
然后才是其它方法。
如果对样品纯度的要求越高，则用来检验纯度的方法应当越多，而且对所得到的数据的解释超应当小心谨慎。
课时作业（十八）
一、选择题
1．在四种化合物：
①NaHCO3；②Al（OH）3；③Al2O3；④H2N—CH2—COOH中与盐酸和氢氧化钠溶液都能反应的是（ ）
A．只有②④B．只有①②
C．只有①②③D．①②③④
解析：
NaHCO3中HCO
能与H＋反应，HCO
＋H＋===H2O＋CO2↑，也能与OH－反应HCO
＋OH－===CO
＋H2O；Al（OH）3、Al2O3均是两性物质，与酸、碱都反应；—NH2能与H＋反应，—COOH能与OH－反应。
答案：
D
2．为了鉴别某白色纺织品的成分是蚕丝还是“人造丝”，通常选用的方法是取一根细丝（ ）
A．滴加浓硝酸B．滴加浓硫酸
C．滴加酒精D．火焰上灼烧
解析：
蛋白质在灼烧时会发出特殊的烧焦羽毛的气味。
答案：
D
3．核糖是细胞核的重要组成部分，是人类生命活动不可缺少的一种物质，其结构简式可表示为CH2OH－（CHOH）3CHO，下列关于核糖的说法不正确的是（ ）
A．在稀酸条件下不能再水解为更简单的糖
B．与银氨溶液反应，还原产物是五羟基戊酸
C．能与氢气发生加成反应生成五元醇
D．在空气中完全燃烧，生成产物为二氧化碳和水
解析：
B项错误，氧化产物为四羟基戊酸。
答案：
B
4．下列有机物水解时断键处（用虚线表示）正确的是（ ）
解析：
选项B是酯的水解，其断键位置是
选项C、D的水解均相当于肽键的水解，其断键位置是
答案：
A
5．蛋白质溶液分别做如下处理后，仍不失去生理作用的是（ ）
A．加热B．紫外线照射
C．加饱和硫酸钠溶液D．加福尔马林
解析：
蛋白质溶液处理后仍不失去生理作用，说明蛋白质发生了盐析，故选C。
A、B、D都使蛋白质发生变性。
答案：
C
6．甘氨酸和丙氨酸混合，在一定条件下发生缩合反应生成二肽的化合物共有（ ）
A．4种B．3种
C．2种D．1种
解析：
同种氨基酸缩合反应生成二肽的化合物各有一种，甘氨酸和丙氨酸发生缩合反应生成二肽的化合物有两种。
答案：
A
7．将盛有适量淀粉浆和淀粉酶的半透膜袋浸入蒸馏水水流中，经较长时间后取出袋内液体，分别用碘水、新制氢氧化铜（加热）、浓硝酸（微热）检验，观察到的现象分别是（ ）
A．显蓝色 黑色沉淀 显黄色
B．不显蓝色 黑色沉淀 显黄色
C．显蓝色 红色沉淀 不显黄色
D．不显蓝色 红色沉淀 显黄色
解析：
淀粉在淀粉酶的作用下完全水解成葡萄糖，留在袋内的是酶。
答案：
B
8．天然蛋白质水解时，不能得到的氨基酸是（ ）
解析：
天然蛋白质水解时只能得到α氨基酸，四个选项中C不是α氨基酸，故不是天然蛋白质水解的产物。
答案：
C
9．阿斯巴甜具有清爽的甜味，甜味度约为蔗糖的200倍。
下列有关说法不正确的是（ ）
A．阿斯巴甜的分子式为C14H18N2O5
B．水解产物中有两种氨基酸
C．阿斯巴甜属于蛋白质
D．阿斯巴甜一定条件下既能与酸反应，又能与碱反应
解析：
根据阿斯巴甜的结构简式，可以求得其分子式为C14H18N2O5，该物质不是蛋白质；其分子中含有
阿斯巴甜中存在—NH2，可以与酸反应，还存在—COOH，可以与碱反应。
答案：
C
10．组成生物体蛋白质的12种氨基酸的平均相对分子质量为128，一条含有100个肽键的多肽链的相对分子质量为（ ）
A．12928B．11128
C．12800D．11000
解析：
根据缩合的概念可知，该多肽链共有100个肽键，且是一条，故应由101个氨基酸分子缩合而成，同时脱去100分子水，因此多肽链的相对分子质量＝101×128－100×18＝11128，故选B。
答案：
B
二、非选择题
11．回答下列问题：
（1）从鸡蛋白的溶液中提取蛋白质的方法有________和________。
（2）鸡蛋腐烂时，常闻到有刺激性气味的气体，该气体主要是________，说明蛋白质中含有________元素。
（3）误食重金属盐会中毒，这是因为________。
（4）浓硝酸溅到皮肤上，使皮肤呈现________色，这是由于浓硝酸和蛋白质发生了________反应的缘故。
（5）鉴定一种织物的成分是真丝还是人造丝，可各取一小块进行________，这是因为________________________________________。
解析：
（1）提取蛋白质的方法可以从两方面考虑，一是让蛋白质沉淀出来，一是让其他物质分离出去；
（2）鸡蛋腐烂时，蛋白质分解放出的硫化氢气体具有刺激性气味；（3）重金属离子会使蛋白质变性；（4）蛋白质可与浓硝酸等许多试剂发生特殊的颜色反应；（5）人造丝是合成纤维，真丝是蛋白质，两者灼烧时的气味不同。
答案：
（1）盐析 渗析
（2）H2S 硫 （3）重金属盐会使蛋白质变性 （4）黄 颜色 （5）灼烧 真丝是蛋白质，灼烧时有烧焦羽毛的气味
12．A、B两种有机物的分子式相同，都可用CaHbOcNd表示，且a＋c＝b，a－c＝d。
已知：
A是天然蛋白质水解的最终产物；B是一种含有醛基的硝酸酯。
试回答：
（1）A和B的分子式是________。
（2）光谱测定显示，A的分子结构中不存在甲基，则A的结构简式是________。
（3）光谱测定显示，B的烃基中没有支链，则B的结构简式是________。
解析：
（1）因B是含醛基的硝酸酯，可设其结构简式为
与CaHbOcNd相比较得d＝1，c＝4；则a＝5，b＝9，有机物的分子式为C5H9O4N。
（2）A是天然蛋白质水解的最终产物，即氨基酸，则A中
（3）由
（1）可得出B的结构简式为
答案：
（1）C5H9O4N
13．紫杉醇是一种新型抗癌药，其分子式为C47H51NO14，它是由如下的A酸和B醇生成的一种酯。
B：
R—OH（R是一个含C、H、O的基团）
（1）A可在无机酸催化下水解，其反应方程式是______________________。
（2）A水解所得的氨基酸不是天然蛋白质水解产物，因为氨基不在（填希腊字母）________位。
（3）写出ROH的分子式：
______________________________________。
解析：
化合物A中存在—NH—CO—原子团，其酸性催化水解应在NH—CO之间发生，其中—NH—转变成—NH2，—CO—转变成—COOH，前者得到β氨基酸，因而不是构成天然蛋白质的氨基酸，醇B的分子式可由紫杉醇的分子式与酸A的分子式相减，再加上1分子水而得出。
14．
（1）α氨基酸能与HNO2反应得到α羟基酸。
如：
试写出下列变化中A、B、C、D四种有机物的结构简式：
A：
________、B：
________、C：
________、D：
________。
（2）下列物质中，既能与NaOH反应，又能与硝酸反应，还能水解的是________（填选项序号）。
①Al2O3 ②Al（OH）3 ③氨基酸 ④二肽
⑦NaHCO3 ⑧纤维素 ⑨蛋白质 ⑩NH4I
A．①②③④B．④⑤⑥⑦⑨⑩
C．③④⑤⑥⑧⑨D．全部
（3）下列有关蛋白质的叙述中正确的是________。
①蛋白质溶液里加入饱和硫酸铵溶液，有沉淀析出，再加入水，也不溶解 ②温度越高，酶催化的化学反
应越快 ③天然蛋白质的水解最终产物几乎均为α氨基酸 ④重金属盐能使蛋白质变性，所以误食重金属盐会中毒 ⑤氨基酸和蛋白质均是既能与强酸反应又能与强碱反应的两性物质 ⑥通常用酒精消毒是因为酒精能使细菌中的蛋白质变性而失去生理活性 ⑦鉴别织物是蚕丝还是人造丝，可用灼烧闻气味的方法
解析：
（1）生成A的反应是中和反应，生成B的反应是题给信息的应用，只要把—NH2改写成—OH即可；生成C的反应从题目中可知是氨基酸的自身脱水反应；生成D的反应从B的结构可推得是酯化反应。
（2）Al2O3、Al（OH）3、氨基酸与NaOH、HNO3均能发生反应，但三者均不能发生水解反应；二肽和蛋白质分子结
羟基与NaOH反应，—COONa与HNO3反应，且—COONa能发生水解；（NH4）2CO3为弱酸弱碱盐，既能水解，又能与HNO3和NaOH反应；HCO
可水解，也可与HNO3和NaOH反应；纤维素与NaOH不反应；NH4I与NaOH发生反应NH
＋OH－NH3·H2O，与HNO3发生氧化还原反应，且NH
能发生水解。
故选B。
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