油田 注水细菌试剂方法及对照表.docx

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油田注水细菌试剂方法及对照表

内部材料

中海油天然气股份有限公司

油藏本源菌常规检测推荐方法及对照表

1.主题内容与适用范围

本方法的目的是对油田油藏中的本源微生物进行普查，为在油藏中进行的微生物提高采收率作业提供判断与依据。

本标准规定了油藏中本源微生物分析的术语、方法原理、试剂和材料、仪器和设备、操作步骤、细菌记数方法、精密度和分析结果。

　　本标准适用于油藏中腐生菌TGB、烃氧化菌HOB、硝酸盐还原菌NRB、厌氧发酵菌FMB、硫酸盐还原菌SRB、产甲烷菌MPB的分析。

油藏中其它本源菌的分析可参照执行。

2.参照标准

SY/T0532—93油田注入水细菌分析方法绝迹稀释法

GB4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂

3.术语

干热灭菌：

将待灭菌的物品放入烘箱中，逐渐升温至140-160℃，维持2-3h，达到灭菌的目的。

湿热灭菌：

将培养基和其它不宜干热灭菌的物品放入高压灭菌锅中，加热，使锅内蒸汽压达0.1MPa，持续20-30min，达到灭菌的目的。

4.测试原理

绝迹稀释法：

将待测水样按固定比例逐级注入到测试瓶或试管中进行接种稀释，直到最后一个测试瓶或试管中无菌生长为止，然后根据细菌生长情况和稀释倍数，计算出水样中细菌的数目。

5.试剂和材料

a化学试剂（均为分析纯）：

乳酸钠、氯化钠、氢氧化钠、硫酸钠酚红、硫酸亚铁铵、硝酸铵、氯化铵、柠檬酸铁铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、尿素、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸镁等。

b生物试剂：

牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、酵母粉等。

c维生素：

烟酸、核黄素、叶酸、VB12、盐酸吡哆醇、D-泛酸钙、生物素、硫胺素等。

d材料：

纱布、脱脂棉、牛皮纸、线绳、6号针头等。

6.仪器和设备

a电热恒温培养箱：

使用温度30~60℃±1℃；

b电热鼓风干燥箱：

使用温度30~300℃±5℃；

c高压灭菌锅;

d托盘天平:

最大称量100g,感量0.1g;

e冰箱;

f酸度计:

刻度为0.1ph单位;

g电炉:

1000~2000W;

h烧杯:

100,500,1000ml;

i三角瓶:

500,1000ml;

j量筒:

250,500ml;

k试管:

150mm×15mm若干个;

l移液管:

1ml;

m酒精灯;

n注射器:

1ml;

o细口瓶:

125ml;

p显微镜　　　

q水浴

　r吸管：

1mL，10mL。

　　s试管。

　　t平皿。

　u接种环或接种针

w厌氧培养装置

x腐生菌测试瓶、烃氧化菌测试瓶、厌氧发酵菌测试瓶、硫酸盐还原菌测试瓶、产甲烷菌测试瓶。

7.采样

采集的水样应具有代表性。

取样前，取样容器必须灭菌，推荐使用湿热灭菌。

取样前的准备：

取样人穿戴好工作服、手套、防护眼镜，带上酒精棉球、棉纱、卫生纸、记录本和记号笔等。

与油井管理人员联系，取得许可后进入井区。

油水井检查：

观查井生产情况，检查管道和各阀门的工作状态，需要倒工作流程的，应要求当班工人倒流程。

对于掺水生产井，先关闭掺水阀门，正常生产5分钟后再取样；对于含气量高的井，必须先进行放气处理，放气前要打开气体报警器，同时打开窗户，使空气流通。

取样：

在正常生产的情况下，在井口或集输小站分离器前的取样口进行取样。

取样时，将取样阀打开，使水以5~61/min的流速畅流3min后，再用水样洗涮容器三遍，然后接取样品。

样品装满后立刻加塞塞紧，盖上盖子，随即帖上标签，注明取样日期、时间、地点、取样条件及取样人、样品数等，并将相关信息同时记录在取样记录本上面。

同一样品最好取2-3个，以便进行对比和平行样分析，也便于进行水化学的分析。

清洁现场：

取样结束后，要对取样现场进行清洁处理，经油井管理人员验收合格后离开现场。

样品保藏和运输：

运输过程中避免曝晒或霜冻。

如取样现场距离分析检测地较远，应将样品在低温保藏箱中保藏。

建议取样后尽快进行分析，如不能立即分析，样品取回后保存于6℃冰箱中，从取样到检测样品最好不超过24小时。

8.样品的预处理

对含砂、泥等杂质样品分析前应静置；含油样品分析烃氧化菌时，应用无菌棉过滤除油；分析严格厌氧的产甲烷菌时，样品应在无氧条件下取样。

9.分析步骤

在六类菌的分析中，推荐次序为先厌氧后耗氧。

通常按“产甲烷菌MPB-硫酸盐还原菌SRB-厌氧发酵菌FMB-烃氧化菌HOB-腐生菌TGB-硝酸盐还原菌NRB”的次序。

分析过程中推荐使用油藏平均温度和35℃两个温度，35℃的数据便于不同油藏温度区块的对比。

9.1商品液体测试瓶法

部分培养基有商品测试瓶出售，如北京华兴化学试剂厂生产的硫酸盐还原菌、腐生菌等，可用此方法分析。

9.1.1估计水样中细菌的量，将数个装有相应菌类培养基的测试瓶排成一组并依次编上序号。

9.1.2用75%的酒精溶液消毒操作者的手及测试瓶顶盖。

9.1.3用无菌注射器吸取1ml水样注入到1号瓶内，摇匀。

9.1.4另取一只无菌注射器，从1号瓶中吸取1ml液体注入到2号瓶中，摇匀。

9.1.5重复上述操作程序，根据含菌量多少稀释到最后所需浓度。

9.1.6放入恒温箱中培养。

9.1.7腐生菌培养7d，测试瓶中液体由红色变为黄色或浑浊，即表示有腐生菌生长。

硫酸盐还原菌培养14－21d，测试瓶中液体变为黑色，即表示有硫酸盐还原菌生长。

9.2自制液体测试瓶/液体试管法

在分析中，测试瓶和试管可互换通用，但要注意分析厌氧的硝酸盐还原菌NRB、厌氧发酵菌FMB、硫酸盐还原菌SRB、产甲烷菌MPB这四类菌时应选用厌氧试管。

9.2.1产甲烷菌的分析

培养基的成分：

表1产甲烷菌培养基（g/L）

药品

加量（g）

药品

加量（g）

K2HPO4.3H2O

0.4

NH4Cl

1.0

KH2PO4

0.2

MgCl2。

6H2O

0.1

胰蛋白胨

1.0

酵母膏

1.0

L-盐酸半胱氨酸

0.5

0.1%刃天青

1ml

乙酸钠

2.0

微量元素浓缩液

1ml

甲酸钠

2.0

复合维生素浓缩液

1ml

H2/CO280：

20充满试管空间

使用前每5ml培养基加入0.1ml1%Na2S和0.05ml10%NaHCO3

配制水

蒸馏水

PH

7.0—7.2

实验步骤：

1）无氧无菌储液的制备：

先用煮沸除氧、通高纯N2至冷却的蒸馏水作为配剂水。

配制以下溶液：

0.1%刃天青。

1%Na2S和10%NaHCO3的溶液，配制过程中继续通入高纯N2，最好压盖后能保持2个大气压。

微量元素浓缩液（配方见表2）：

先将4.5克N（CH3COOH）3溶于90ml含NaOH1.8克的水溶液中，再加入其它药品，定容至100ml。

表2：

厌氧用微量元素溶液成分（g/100ml）

药品

加量

药品

加量

N（CH3COOH）3

4.5

FeCl2.4H2O

0.4

MnCl2.4H2O

0.1

CoCl2.6H2O

0.12

AlK（SO4）2

0.01

ZnCl2

0.1

NaCl

1.0

CaCl2

0.02

Na2MoO4

0.01

H3BO3

0.01

配制水

无氧蒸馏水

#N（CH3COOH）3先溶于碱。

避光保存

复合维生素浓缩液（配方见表3）。

表3复合维生素浓缩液成分（mg/100ml）

药品

加量

药品

加量

生物素（Bioton）

2.0

盐酸吡哆醇（PyripoxinHCl,VB6）

10

硫胺素（ThiamineHCl,VB1）

5.0

D-泛酸钙（D-CalcuinPantothenate）

5.0

硫辛酸（Thiocticacid）

5.0

叶酸（Folicacid）

2.0

烟酸（Nicotinicacid,VB2）

5.0

VB12

0.1

核黄素（Riboflavin,VB3）

5.0

对氨基苯甲酸（P-aminobenzicacid）

5.0

配制水

无氧蒸馏水

#存于冰箱，避光保存。

2）培养基的制备：

采用煮沸除氧

根据需要按表1比例逐一加入除Na2S、NaHCO3和半胱氨酸盐外的试剂，调PH为7.0左右，把培养基装入锥形瓶中，划一刻度，另加适量蒸馏水（1L培养基约加200ml蒸馏水），煮沸至原刻度；

通入无氧N2去除气相中的空气；停止加热10分钟左右加入半胱氨酸盐，注意继续通入无氧N210分钟，此时培养基颜色由兰紫色逐渐褪成浅粉色；在厌氧箱内或高纯N2保护下在厌氧箱外分装培养基。

为便于10倍系列稀释，每只测试瓶9ml培养基，为避免漏气，用新的异丁橡胶塞塞紧后加压铝盖。

3）灭菌

将培养基、1%Na2S和10%NaHCO3的溶液、2ml注射器、针头等物品在0.1MPa（121℃）下灭菌20~30分钟。

4）测试方法

调试好厌氧箱并将所需无菌用品移入厌氧箱；对灭菌后的测试瓶进行编号，根据不同样品来源估计菌数，确定最高稀释度；每管培养基用无菌注射器加入0.2ml1%Na2S和0.1ml10%NaHCO3。

用经无氧氮气置换的灭菌注射器从预处理后的样品中抽取1.0ml样品做10倍系列稀释接种，并通入H2/CO2为80:

20的混合气。

每一组均应留一不接种的空白作对照。

测试瓶的稀释接种见附录A：

测试瓶法测细菌总数

5）培养方法

产甲烷菌在培养箱内恒温倒置培养，一般温度为平均油藏温度和35℃，如果有特殊需要可视具体情况而定。

6）阳性管的检出

阳性管，即有待测菌生长的稀释管。

培养2~3周后，用气相色谱测定各稀释管中甲烷的含量，以判定产甲烷菌是否生长，检出阳性管。

7）菌浓的计算

菌浓的计算方法见附录B。

9.2.2厌氧发酵菌的分析

培养基的成分：

表4厌氧发酵菌培养基

药品

加量（g）

药品

加量（g）

NH4Cl

1.0

K2HPO4

0.1

NaCl

0.8

MgSO4

0.2

KCl

0.1

CaCl2

0.02

CaCO3

0.2

微量元素10倍浓缩液

0.9ml

蛋白胨

5.0

复合维生素10倍浓缩液

0.5ml

酵母膏

2.5

葡萄糖

10

PH

7.0

#适用温度为<90℃

实验步骤：

1）培养基的制备

按表4配制培养基，再用1NNaOH或HCl调PH。

发酵菌培养基应先煮沸除氧：

在培养基中加适量蒸馏水（1L培养基约加200m蒸馏水），煮沸至原体积时停止加热，立刻通入高纯N2气10~20分钟，然后可在厌氧箱中或厌氧箱外氮气保护下分装。

每瓶分装9ml培养基，用压盖器压上铝盖。

在厌氧箱外分装时，气针需插入测试瓶中，通高纯N2弱气流（对脸能感觉即可），培养基冒泡数秒后，拔针同时塞紧胶塞。

2）灭菌

将这些物品及1ml注射器、针头在0.056MPa（112℃）下灭菌25分钟。

3）测试方法

测试可用单组或多组测试瓶，有条件的实验室最好在无菌间操作。

将测试瓶编号，每组留一瓶空白培养基作对照，编号为“0”，具体操作见附录A：

细菌测试瓶法。

4）培养方法

接种后，放入培养箱中培养，14天后以培养基的混浊判断厌氧菌的存在。

特别注意观察测试瓶底部，厌氧菌在底部生长较多。

如空白样有菌生长，应重做。

5）菌浓的计算

菌浓的计算方法见附录B。

9.2.3硫酸盐还原菌（SRB）的分析

培养基配方见表5。

表5硫酸盐还原菌培养基

药品

加量（g/L）

药品

加量（g/L）

乳酸