流式细胞仪操作规程 SOP.docx
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流式细胞仪操作规程SOP
流式细胞仪操作规程目录
1:
淋巴细胞亚群测定及绝对计数
2:
活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测
3:
HLA-B27测定
4:
CD55/CD59测定
5:
干细胞检测和绝对计数
6:
白血病免疫分型测定
7:
淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定
8:
细胞周期分析
9:
活化血小板检测
10:
血小板抗体测定
11:
红细胞抗体测定
12:
粒细胞抗体测定
淋巴细胞亚群测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号:
200年月日起实施
第1版
(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期:
年月日
复审人:
规程编写者:
审批者:
批准日期:
年月日
文件分发部门和/或个人
院档案室保管者:
检验科主任:
检验科实验室:
淋巴细胞亚群测定
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)
原理:
双/三色/四色直接免疫荧光法。
荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中,与白细胞膜上相应的抗原结合,经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析,从而得到淋巴细胞亚群的百分数,加入Flow-Count即可得出绝对计数。
淋巴细胞表面抗原分布如下:
T淋巴细胞:
CD3+;B淋巴细胞:
CD3-,CDl9+;辅助性T淋巴细胞:
CD3+CD4+;抑制性T淋巴细胞:
CD3+CD8+;NK细胞:
CD3-CDl6+56+等。
根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同,流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群,利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数,加入Flow-Count组会自动得出绝对计数。
标本采集与处理
受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。
采集部位静脉采血
抗凝剂EDTA或肝素抗凝血
要求1.样本量1ml。
2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻或溶血的标本不能用。
3.样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。
若>10.0×109/L,样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核细胞。
试剂
品牌剂型规格贮存
贝克曼库尔特
成分1:
单克隆抗体液体2—8℃
(CD45/4/8/3No.6607013CD45/56/19/3No.6607073
CD4/8/3No.IM1650同型对照IgG1/IgG1/IgG1No.IM1672
CD3/19No.IM1293CD3/16+56No.IM2076CD19-PC5No.IM2643
Flow-Count荧光微球No.7547053)
2:
全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)
A:
甲酸液体70ML室温
B:
碳酸钠等液体32ML室温
C:
多聚甲醛液体14ML室温
(OptilyseCNo.IM1401)液体室温
3:
鞘液(No.8546859)液体20L室温
4:
清洗液(No.8546930)液体5L室温
5:
荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8℃(Flow-Check)
仪器
BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra
样本制备:
1)按照要求,分别向已编好号的试管中加入10/20ul单克隆抗体和同型对照
2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
3)混匀,避光,室温孵育20-30分钟
4)溶血:
a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)
b.使用COULTERQ—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
(*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体)
5)上机测样(可根据样本情况选择洗或不洗上样)
6)需要做绝对计数的指标,在相应管中加入与血样等量的Flow-Count(务必做到三同:
同枪,同人,同种方法加Flow-Count,而且加完即上机)
报告结果
报告百分数(和绝对值)
操作性能
精密度批内五次重复CV<2%
参考值(百分数(绝对值))
CD3+60.8-75.4%(1141-1880)CD4+29.4-45.8%(478-1072)
CD8+18.2-32.8%(393-742)NK9.5-23.5%(175-567)
Th/Ts1.05-2.03
临床意义
1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标,在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染,自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。
临床常用Th/Ts比值来判断病人的免疫状况。
Th/Ts比值升高:
表示免疫功能亢进:
见于自身免疫性疾病,如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。
Th/Ts比值减低:
表示免疫功能下降:
艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。
2:
NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞,所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。
NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂,疲劳综合征病人等,NK活性随年龄增长而减退。
NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应,白介素-2治疗后;外周血NK细胞增加。
方案(Protocol)
1.选参数
点击
点击
4色
3色
点击
(命名,点击save)
2.画图
结果
此图为CD45圈门
如果做绝对计数,则
填写Flow-Count的浓度
选中cell/ul即可
活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的测定
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)
原理:
双/三色直接免疫荧光法。
荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中,与白细胞膜上相应的抗原结合,经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析,从而得到相应各亚群的百分数。
活化淋巴细胞表面抗原为CD3+/CD25+和CD3+/HLA-DR+。
CD3+/CD45RO+是记忆型T细胞。
CD3+/CD45RA+是纯真型T细胞。
标本采集与处理
受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。
采集部位静脉采血
抗凝剂EDTA或肝素抗凝血
要求1.样本量1ml。
2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻或溶血的标本不能用。
3.样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。
若>10.0×109/L,样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核细胞。
试剂
品牌剂型规格贮存
贝克曼库尔特
成分1:
单克隆抗体液体2—8℃
(CD3/HLA-DRNo.IM1295CD25-PC5No.IM2646
CD3-FITCNo.IM1281CD45RA-PENo.IM1834
CD45RO-PENo.IM1307CD4-PC5No.IM2636)
2:
全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)
A:
甲酸液体70ML室温
B:
碳酸钠等液体32ML室温
C:
多聚甲醛液体14ML室温
(OptilyseCNo.IM1401)液体室温
3:
鞘液(No.8546859)液体20L室温
4:
清洗液(No.8546930)液体5L室温
5:
荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8℃(Flow-Check)
仪器
BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra
样本制备:
1)按照要求,分别向已编好号的试管中加入10/20ul单克隆抗体和同型对照
2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
3)混匀,避光,室温孵育20-30分钟
4)溶血:
a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)
b.使用COULTERQ—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
(*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体)
5)上机测样(可根据样本情况选择洗或不洗上样)
报告结果
报告百分数
操作性能
精密度批内五次重复CV<2%
参考值(百分数)
CD3+/HLA-DR+3.1±1.3%CD3+/CD25+15.9±3.7%
CD3+/CD45RO+3.3±1.55%CD3+/CD45RA+/CD4+20.51±3.64%
临床意义
1.HLA-DR、CD25、CD69是T细胞活化各个时期表达的标志性抗原,对其进行检测可以判断出疾病的进程,有助于临床疾病的辅助诊断、预后和治疗。
如活化状态的监测是对机体移植免疫状况判断的最主要依据,有助于临床选择治疗方案,CD25+/CD3+>5-10%提示排斥、持续增加提示应作病理活检;CD3+/HLA-DR+增加5-10%但不伴CD25增加提示MCV感染。
2.正常机体内各种T细胞之间以及与其他免疫细胞之间在数量上保持一定比例,如果它们之间比例失调就会引起免疫功能紊乱,将导致机体免疫力下降和感染性疾病、自身免疫病、肿瘤等疾病的发生,检测淋巴细胞各种亚群有助于疾病的诊断、预后和治疗。
CD45RA、CD45RO均为T细胞的辅助分子,CD45RA+纯真型T细胞当免疫力下降时减少;CD45RO+记忆型T细胞对第二次抗原刺激极其敏感,通常在急性感染疾病中增加,在慢性感染疾病中减少。
方案(Protocol)
同淋巴细胞亚群检测
结果(Result)
HLA-B27测定
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)
原理:
双色直接免疫荧光法。
将HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE单克隆抗体加入到全血中,与白细胞膜上相应的抗体结合,经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析,测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。
标本采集与处理
受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。
采集部位静脉采血
抗凝剂EDTA或肝素抗凝血
要求1.样本量1ml。
2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用。
3.样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。
若>10.0×109/L,样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核细胞。
4.溶血样本不能用。
试剂
品牌剂型规格贮存
贝克曼库尔特
成分1:
单克隆抗体液体1ML2—8℃
(HLA-B27/HLA-B7No.IM1502同型对照IgG1/IgG2aNo.IM1389))
2:
全血溶血试剂液体
A:
甲酸液体70ML室温
B:
碳酸钠等液体32ML室温
C:
多聚甲醛液体14ML室温
3:
鞘液液体20L室温
4:
清洗液液体5L室温
5:
荧光微球液体10ML2-8℃
质控品BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:
遇特殊情况随时进行校准。
仪器
BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra
样本制备:
1)按照要求,分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITC/IgG1-PE)
2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
3)混匀,避光,室温孵育20-30分钟
4)溶血:
a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)
b.使用COULTERQ—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
(*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体)
5)洗、离心、上机测样(备注:
测B27一定要至少洗一遍方可上机检测)
报告结果
报告阴阳性
操作性能
精密度批内五次重复CV<2%
参考值
阳性:
HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在5.0以上,阳性率>90%。
临床意义
HLA复合体位于第6号染色体的短臂上,该区DNA片段长度约3000-4000KB,占人体整个基因的1/3000,HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因,与多种疾病具有相关性,尤其是强直性脊柱炎。
HLA-B27基因属于?
型MHC基因,所有有核细胞上均有表达,尤其是淋巴细胞表面含量丰富,人们发现HLA-B27抗原表达与强直性脊柱炎有高度的相关性,超过90%的强直性脊柱炎患者HLA-B27抗原表达阳性,而正常人群中仅5-10%的认为阳性。
由于强直性脊柱炎症状与许多疾病相类似,临床上难以确诊,因此HLA-B27检测在疾病的诊断中具有重要意义,HLA-B27的检测是该疾病诊断和鉴别诊断中的一个重要指标。
方案(Protocol)
1.选参数
点击
点击
键入文件名,点击Save
2.画图
结果
1.positive(+)
X-Mean=17.1
2.negative(-)
X-Mean=1.2X-Mean=5.8
CD55/CD59测定
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)
原理:
双色直接免疫荧光法。
近年的研究表明,红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。
血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。
用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。
标本采集与处理
受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。
采集部位静脉采血
抗凝剂EDTA或肝素抗凝血
要求1.样本量1ml。
2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用。
3.溶血样本不能用。
试剂
品牌剂型规格贮存
贝克曼库尔特
成分1:
单克隆抗体液体1ML2—8℃
(CD59-FITCNo.IM3457CD55-PENo.IM2726)
2:
全血溶血试剂液体
A:
甲酸液体70ML室温
B:
碳酸钠等液体32ML室温
C:
多聚甲醛液体14ML室温
3:
鞘液液体20L室温
4:
清洗液液体5L室温
5:
荧光微球液体10ML2-8℃
质控品BEKAMANCOULTER产品,未开瓶的试剂于2-8℃保存,可在有效期内保持稳定,稀释的试剂于2-8℃可稳定2周;每天校准一次:
遇特殊情况随时进行校准。
仪器
BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra
样本制备:
(一)白细胞CD55/CD59检测
1.准备2支流式细胞仪专用管,分别标记。
分别向二管中加入样品100ul。
2.溶血:
a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)
b.使用COULTERQ—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
(*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体)
3.离心后分别加入CD55/CD5910ul和相应的同型对照10ul。
避光20-30分钟。
4.洗涤离心
5.上机测样
(二)红细胞CD55/CD59检测
1.准备2支流式细胞仪专用管,分别标记
2.分别加入CD55/CD5910ul和相应的同型对照10ul。
3.向二管中加入1:
200稀释的样品100ul(可根据红细胞的数量调整),避光20-30分钟。
4.洗涤离心。
5.混匀、上机测样。
报告结果
报告百分数
操作性能
精密度批内五次重复CV<2%
参考值
CD55>97%CD59>97%
PNH的临界值:
RBCCD59>95%WBCCD59>90%
PNH的诊断值:
RBCCD59>91%大部分>80%
中性粒细胞CD59>84%
临床意义
用于AA和PNH的诊断和分型诊断。
PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。
方案(Protocol)(同HLA-B27)
结果
1.RBC:
normal
2.RBC:
abnormal
3.WBC
干细胞检测和绝对计数
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)
原理:
双色直接免疫荧光法。
荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中,与干细胞膜上相应的抗原结合,经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析,从而得到百分数,加入Flow-Count即可得出绝对计数。
标本采集与处理
受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。
采集部位静脉采血
抗凝剂EDTA或肝素抗凝血
要求1.样本量1ml。
2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻或溶血的标本不能用。
3.样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。
若>10.0×109/L,样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核细胞。
试剂
品牌剂型规格贮存
贝克曼库尔特
成分1:
单克隆抗体液体2—8℃
(CD34No.IM1871CD45-PC5No.IM2653/IM2652
Flow-Count荧光微球No.7547053)
2:
全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)
A:
甲酸液体70ML室温
B:
碳酸钠等液体32ML室温
C:
多聚甲醛液体14ML室温
(OptilyseCNo.IM1401)液体室温
3:
鞘液(No.8546859)液体20L室温
4:
清洗液(No.8546930)液体5L室温
5:
荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8℃(Flow-Check)
仪器
BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra
样本制备:
1)按照要求,分别向已编好号的试管中加入10ul单克隆抗体和同型对照
2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
3)混匀,避光,室温孵育20-30分钟
4)溶血:
a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)
b.使用COULTERQ—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
(*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体)
5)需要做绝对计数时,在相应管中加入与血样等量的Flow-Count(务必做到三同:
同枪,同人,同种方法加Flow-Count,而且加完即上机)
6)上机测样
报告结果
报告百分数(和绝对值)
操作性能
精密度批内五次重复CV<2%
参考值(百分数(绝对值))
CD34+/CD45+0.58±0.29%
临床意义
目前把CD34作为造血干细胞的主要标志,CD34阳性细胞计数作为造血干细胞水平定量的检测方法。
方案(Protocol)
同淋巴细胞亚群检测
结果(Result)
白血病免疫分型测定
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)
原理:
双色直接免疫荧光法。
荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中,与细胞膜上或膜内相应的抗原结合,经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析,从而得到百分数。
标本采集与处理
受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。
采集部位骨髓采血
抗凝剂EDTA或肝素抗凝
要求1.样本量1ml。
2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻或溶血的标本不能用。
3.样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。
若>10.0×109/L,样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核细胞。
试剂
品牌剂型规格贮存
贝克曼库尔特
成分1:
单克隆抗体液体2—8℃
(CD34No.IM1871CD45-PC5No.IM2653/IM2652
Flow-Count荧光微球No.7547053)
2:
全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)
A:
甲酸液体70ML室温
B:
碳酸钠等液体32ML室温
C:
多聚甲醛液体14ML室温
(OptilyseCNo.IM1401)液体室温
3:
鞘液(No.8546859)液体20L室温
4:
清洗液(No.8546930)液体5L室温
5:
荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8℃(Flow-Check)
仪器
BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra
操作-样本制备:
细胞膜表面抗原
1.首先准备所需的管,并在管上标记上欲加入的抗体。
2.首先每管中加入5ulCD45-PC5抗体。
3.然后,按管上的标记,加入相应抗体各10ul(注意:
必须是FITC和PE标记的抗体搭配)
4.各管中加入标本(骨髓或外周血)30~100u1(根据细胞的多少决定),振荡混匀,室温避光20~30分钟。
5.溶血:
a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)
b.使用COULTERQ—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
(*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体)
细胞浆和核抗原
1.准备所需的管,并在管上标记上欲加入的抗体,其中一管是同型对照。
2.首先每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定),5ulCD45-PC5抗体。
室温避光20分钟。
3.每管中加入固定液100ul,剧烈振荡混匀,室温避光15分钟。
4.各管中加入PBS4ml。
5.300g离心5分钟后,弃去上清液,振荡混匀。
(1500r/min*5min)
6.各管中加入透膜剂100ul,轻轻混匀,室温避光5分钟。
7.加抗体,阴性对照管中加入10ul,其余各管加入相应抗体各10ul,室温避光15分钟。
8.各管中加入4mlPBS,振荡混匀。
9.300g离心5分钟后,弃去上清液。
10.各管中加入PBS500ul,振荡混匀。
11.上机测样
报告结果
报告百分数
操作性能
精密度批内五次重复CV<2%
参考值
CD34+<5%MPO+<5%
粒系<20%淋系<30%
临床意义
用于血液病的诊断和分型诊断
方案(Protocol)
T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter,贝克曼库尔特)
原理:
直接免疫荧光法。
肝素钠抗凝全血在PMA,Ionomycin和Monensin存在下短期培养(辅助性T细胞通过细胞因子IFN-γ、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。
淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子,且迅速分泌到细胞外。
因此,利用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞,然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外,使细胞因子在细胞内滞留到一定的量),然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色,使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN-γ和IL-4进行测定。
标本采集与处理
受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。
采集部位静脉采血
抗凝剂肝素抗凝血
要求1.样本量至少1ml。
2.样本应在采集后6小时内处理,冷冻的标本不能用。
3.样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。
若>10.0×109/L,样本需要稀释,用PBS稀释;若<4.0×109/L,应分离单个核细胞。
4.溶血样本不能用。