流式细胞仪操作规程 SOP.docx

流式细胞仪操作规程 SOP.docx

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流式细胞仪操作规程SOP

流式细胞仪操作规程目录

1：

淋巴细胞亚群测定及绝对计数

2：

活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测

3：

HLA-B27测定

4：

CD55／CD59测定

5：

干细胞检测和绝对计数

6：

白血病免疫分型测定

7：

淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定

8：

细胞周期分析

9：

活化血小板检测

10：

血小板抗体测定

11：

红细胞抗体测定

12：

粒细胞抗体测定

淋巴细胞亚群测定

（流式细胞仪）

医院检验科

操作规程文件号：

200年月日起实施

第1版

（共3页）

本规程每2年复审一次

复审日期：

年月日

复审人：

规程编写者：

审批者：

批准日期：

年月日

文件分发部门和／或个人

院档案室保管者：

检验科主任：

检验科实验室：

淋巴细胞亚群测定

方法

流式细胞仪（BeckmanCoulter，贝克曼库尔特）

原理：

双/三色/四色直接免疫荧光法。

荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。

淋巴细胞表面抗原分布如下：

T淋巴细胞：

CD3+；B淋巴细胞：

CD3-，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：

CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：

CD3+CD8+；NK细胞：

CD3-CDl6+56+等。

根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count组会自动得出绝对计数。

标本采集与处理

受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。

采集部位静脉采血

抗凝剂EDTA或肝素抗凝血

要求1．样本量1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

试剂

品牌剂型规格贮存

贝克曼库尔特

成分1：

单克隆抗体液体2—8℃

（CD45/4/8/3No.6607013CD45/56/19/3No.6607073

CD4/8/3No.IM1650同型对照IgG1/IgG1/IgG1No.IM1672

CD3/19No.IM1293CD3/16+56No.IM2076CD19-PC5No.IM2643

Flow-Count荧光微球No.7547053）

2：

全血溶血试剂（Q-Prep）液体（No.7546946）

A：

甲酸液体70ML室温

B：

碳酸钠等液体32ML室温

C：

多聚甲醛液体14ML室温

（OptilyseCNo.IM1401）液体室温

3：

鞘液（No.8546859）液体20L室温

4：

清洗液（No.8546930）液体5L室温

5：

荧光微球（No.6605359）液体10ML2-8℃（Flow-Check）

仪器

BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra

样本制备：

1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20ul单克隆抗体和同型对照

2）分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟

4）溶血：

a.OptiLyseC（按说明书步骤溶血）

b.使用COULTERQ—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）

5）上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）

6）需要做绝对计数的指标，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count（务必做到三同：

同枪，同人，同种方法加Flow-Count，而且加完即上机）

报告结果

报告百分数（和绝对值）

操作性能

精密度批内五次重复CV<2％

参考值（百分数（绝对值））

CD3+60.8-75.4%（1141-1880）CD4+29.4-45.8%（478-1072）

CD8+18.2-32.8%（393-742）NK9.5-23.5%（175-567）

Th/Ts1.05-2.03

临床意义

1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。

临床常用Th／Ts比值来判断病人的免疫状况。

Th／Ts比值升高：

表示免疫功能亢进：

见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。

Th／Ts比值减低：

表示免疫功能下降：

艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。

2：

NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。

NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。

NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。

方案（Protocol）

1.选参数

点击

点击

4色

3色

点击

（命名，点击save）

2.画图

结果

此图为CD45圈门

如果做绝对计数，则

填写Flow-Count的浓度

选中cell/ul即可

活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的测定

方法

流式细胞仪（BeckmanCoulter，贝克曼库尔特）

原理：

双/三色直接免疫荧光法。

荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到相应各亚群的百分数。

活化淋巴细胞表面抗原为CD3+/CD25+和CD3+/HLA-DR+。

CD3+/CD45RO+是记忆型T细胞。

CD3+/CD45RA+是纯真型T细胞。

标本采集与处理

受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。

采集部位静脉采血

抗凝剂EDTA或肝素抗凝血

要求1．样本量1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

试剂

品牌剂型规格贮存

贝克曼库尔特

成分1：

单克隆抗体液体2—8℃

（CD3/HLA-DRNo.IM1295CD25-PC5No.IM2646

CD3-FITCNo.IM1281CD45RA-PENo.IM1834

CD45RO-PENo.IM1307CD4-PC5No.IM2636）

2：

全血溶血试剂（Q-Prep）液体（No.7546946）

A：

甲酸液体70ML室温

B：

碳酸钠等液体32ML室温

C：

多聚甲醛液体14ML室温

（OptilyseCNo.IM1401）液体室温

3：

鞘液（No.8546859）液体20L室温

4：

清洗液（No.8546930）液体5L室温

5：

荧光微球（No.6605359）液体10ML2-8℃（Flow-Check）

仪器

BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra

样本制备：

1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20ul单克隆抗体和同型对照

2）分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟

4）溶血：

a.OptiLyseC（按说明书步骤溶血）

b.使用COULTERQ—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）

5）上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度批内五次重复CV<2％

参考值（百分数）

CD3+/HLA-DR+3.1±1.3%CD3+/CD25+15.9±3.7%

CD3+/CD45RO+3.3±1.55%CD3+/CD45RA+/CD4+20.51±3.64%

临床意义

1.HLA-DR、CD25、CD69是T细胞活化各个时期表达的标志性抗原，对其进行检测可以判断出疾病的进程，有助于临床疾病的辅助诊断、预后和治疗。

如活化状态的监测是对机体移植免疫状况判断的最主要依据，有助于临床选择治疗方案，CD25+/CD3+>5-10%提示排斥、持续增加提示应作病理活检；CD3+/HLA-DR+增加5-10%但不伴CD25增加提示MCV感染。

2.正常机体内各种T细胞之间以及与其他免疫细胞之间在数量上保持一定比例，如果它们之间比例失调就会引起免疫功能紊乱，将导致机体免疫力下降和感染性疾病、自身免疫病、肿瘤等疾病的发生，检测淋巴细胞各种亚群有助于疾病的诊断、预后和治疗。

CD45RA、CD45RO均为T细胞的辅助分子，CD45RA+纯真型T细胞当免疫力下降时减少；CD45RO+记忆型T细胞对第二次抗原刺激极其敏感，通常在急性感染疾病中增加，在慢性感染疾病中减少。

方案（Protocol）

同淋巴细胞亚群检测

结果（Result）

HLA-B27测定

方法

流式细胞仪（BeckmanCoulter，贝克曼库尔特）

原理：

双色直接免疫荧光法。

将HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。

标本采集与处理

受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。

采集部位静脉采血

抗凝剂EDTA或肝素抗凝血

要求1．样本量1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂

品牌剂型规格贮存

贝克曼库尔特

成分1：

单克隆抗体液体1ML2—8℃

（HLA-B27/HLA-B7No.IM1502同型对照IgG1／IgG2aNo.IM1389））

2：

全血溶血试剂液体

A：

甲酸液体70ML室温

B：

碳酸钠等液体32ML室温

C：

多聚甲醛液体14ML室温

3：

鞘液液体20L室温

4：

清洗液液体5L室温

5：

荧光微球液体10ML2-8℃

质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：

遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra

样本制备：

1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照（IgG2a-FITC／IgG1-PE）

2）分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟

4）溶血：

a.OptiLyseC（按说明书步骤溶血）

b.使用COULTERQ—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）

5）洗、离心、上机测样（备注：

测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）

报告结果

报告阴阳性

操作性能

精密度批内五次重复CV<2％

参考值

阳性：

HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在5.0以上，阳性率>90%。

临床意义

HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。

HLA-B27基因属于?

型MHC基因，所有有核细胞上均有表达，尤其是淋巴细胞表面含量丰富，人们发现HLA-B27抗原表达与强直性脊柱炎有高度的相关性，超过90%的强直性脊柱炎患者HLA-B27抗原表达阳性，而正常人群中仅5-10%的认为阳性。

由于强直性脊柱炎症状与许多疾病相类似，临床上难以确诊，因此HLA-B27检测在疾病的诊断中具有重要意义，HLA-B27的检测是该疾病诊断和鉴别诊断中的一个重要指标。

方案（Protocol）

1.选参数

点击

点击

键入文件名，点击Save

2.画图

结果

1.positive（+）

X-Mean=17.1

2.negative（-）

X-Mean=1.2X-Mean=5.8

CD55/CD59测定

方法

流式细胞仪（BeckmanCoulter，贝克曼库尔特）

原理：

双色直接免疫荧光法。

近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。

血细胞（红细胞和白细胞）通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。

用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。

标本采集与处理

受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。

采集部位静脉采血

抗凝剂EDTA或肝素抗凝血

要求1．样本量1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．溶血样本不能用。

试剂

品牌剂型规格贮存

贝克曼库尔特

成分1：

单克隆抗体液体1ML2—8℃

（CD59-FITCNo.IM3457CD55-PENo.IM2726）

2：

全血溶血试剂液体

A：

甲酸液体70ML室温

B：

碳酸钠等液体32ML室温

C：

多聚甲醛液体14ML室温

3：

鞘液液体20L室温

4：

清洗液液体5L室温

5：

荧光微球液体10ML2-8℃

质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：

遇特殊情况随时进行校准。

仪器

BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra

样本制备:

（一）白细胞CD55／CD59检测

1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。

分别向二管中加入样品100ul。

2．溶血：

a.OptiLyseC（按说明书步骤溶血）

b.使用COULTERQ—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）

3．离心后分别加入CD55/CD5910ul和相应的同型对照10ul。

避光20-30分钟。

4．洗涤离心

5．上机测样

（二）红细胞CD55／CD59检测

1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记

2．分别加入CD55／CD5910ul和相应的同型对照10ul。

3．向二管中加入1：

200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光20-30分钟。

4．洗涤离心。

5．混匀、上机测样。

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度批内五次重复CV<2％

参考值

CD55>97%CD59>97%

PNH的临界值：

RBCCD59>95%WBCCD59>90%

PNH的诊断值：

RBCCD59>91%大部分>80%

中性粒细胞CD59>84%

临床意义

用于AA和PNH的诊断和分型诊断。

PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。

方案（Protocol）（同HLA-B27）

结果

1.RBC:

normal

2.RBC:

abnormal

3.WBC

干细胞检测和绝对计数

方法

流式细胞仪（BeckmanCoulter，贝克曼库尔特）

原理：

双色直接免疫荧光法。

荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与干细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。

标本采集与处理

受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。

采集部位静脉采血

抗凝剂EDTA或肝素抗凝血

要求1．样本量1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

试剂

品牌剂型规格贮存

贝克曼库尔特

成分1：

单克隆抗体液体2—8℃

（CD34No.IM1871CD45-PC5No.IM2653/IM2652

Flow-Count荧光微球No.7547053）

2：

全血溶血试剂（Q-Prep）液体（No.7546946）

A：

甲酸液体70ML室温

B：

碳酸钠等液体32ML室温

C：

多聚甲醛液体14ML室温

（OptilyseCNo.IM1401）液体室温

3：

鞘液（No.8546859）液体20L室温

4：

清洗液（No.8546930）液体5L室温

5：

荧光微球（No.6605359）液体10ML2-8℃（Flow-Check）

仪器

BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra

样本制备：

1）按照要求，分别向已编好号的试管中加入10ul单克隆抗体和同型对照

2）分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

3）混匀，避光，室温孵育20-30分钟

4）溶血：

a.OptiLyseC（按说明书步骤溶血）

b.使用COULTERQ—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）

5）需要做绝对计数时，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count（务必做到三同：

同枪，同人，同种方法加Flow-Count，而且加完即上机）

6）上机测样

报告结果

报告百分数（和绝对值）

操作性能

精密度批内五次重复CV<2％

参考值（百分数（绝对值））

CD34+/CD45+0.58±0.29%

临床意义

目前把CD34作为造血干细胞的主要标志，CD34阳性细胞计数作为造血干细胞水平定量的检测方法。

方案（Protocol）

同淋巴细胞亚群检测

结果（Result）

白血病免疫分型测定

方法

流式细胞仪（BeckmanCoulter，贝克曼库尔特）

原理：

双色直接免疫荧光法。

荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与细胞膜上或膜内相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到百分数。

标本采集与处理

受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。

采集部位骨髓采血

抗凝剂EDTA或肝素抗凝

要求1．样本量1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

试剂

品牌剂型规格贮存

贝克曼库尔特

成分1：

单克隆抗体液体2—8℃

（CD34No.IM1871CD45-PC5No.IM2653/IM2652

Flow-Count荧光微球No.7547053）

2：

全血溶血试剂（Q-Prep）液体（No.7546946）

A：

甲酸液体70ML室温

B：

碳酸钠等液体32ML室温

C：

多聚甲醛液体14ML室温

（OptilyseCNo.IM1401）液体室温

3：

鞘液（No.8546859）液体20L室温

4：

清洗液（No.8546930）液体5L室温

5：

荧光微球（No.6605359）液体10ML2-8℃（Flow-Check）

仪器

BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra

操作-样本制备：

细胞膜表面抗原

1．首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。

2．首先每管中加入5ulCD45-PC5抗体。

3．然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul（注意：

必须是FITC和PE标记的抗体搭配）

4．各管中加入标本（骨髓或外周血）30～100u1（根据细胞的多少决定），振荡混匀，室温避光20～30分钟。

5．溶血：

a.OptiLyseC（按说明书步骤溶血）

b.使用COULTERQ—PREP制备系统

开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。

（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）

细胞浆和核抗原

1．准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。

2．首先每管中加入标本（骨髓或外周血）100ul（根据细胞的多少决定），5ulCD45-PC5抗体。

室温避光20分钟。

3．每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。

4．各管中加入PBS4ml。

5．300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。

（1500r/min*5min）

6．各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。

7．加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。

8．各管中加入4mlPBS，振荡混匀。

9．300g离心5分钟后，弃去上清液。

10．各管中加入PBS500ul，振荡混匀。

11．上机测样

报告结果

报告百分数

操作性能

精密度批内五次重复CV<2％

参考值

CD34+<5%MPO+<5%

粒系<20%淋系<30%

临床意义

用于血液病的诊断和分型诊断

方案（Protocol）

T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测

方法

流式细胞仪（BeckmanCoulter，贝克曼库尔特）

原理：

直接免疫荧光法。

肝素钠抗凝全血在PMA，Ionomycin和Monensin存在下短期培养（辅助性T细胞通过细胞因子IFN-γ、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。

淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子，且迅速分泌到细胞外。

因此，利用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞，然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外，使细胞因子在细胞内滞留到一定的量），然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色，使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN-γ和IL-4进行测定。

标本采集与处理

受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。

采集部位静脉采血

抗凝剂肝素抗凝血

要求1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。