流式细胞仪操作规程 SOP.docx

1、流式细胞仪操作规程 SOP流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测3：HLA-B27测定4：CD55CD59测定5：干细胞检测和绝对计数6：白血病免疫分型测定7：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-/IL-4测定8：细胞周期分析9：活化血小板检测10：血小板抗体测定11：红细胞抗体测定12：粒细胞抗体测定淋巴细胞亚群测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200年月日起实施第1版(共3页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：淋巴细胞

2、亚群测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双/三色/四色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD3-，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋

3、巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count组会自动得出绝对计数。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1样本量1ml。2样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。3样本白细胞计数应在4.0-10.0109/L之间。若10.0109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核细胞。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体28(CD45/4/8/3No.6607013CD45/56/19/3No.6607073CD4/8/3No.IM1650同型对照IgG1/IgG1/IgG1No.IM

4、1672CD3/19No.IM1293CD3/16+56No.IM2076CD19-PC5No.IM2643Flow-Count荧光微球No.7547053)2：全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温(OptilyseCNo.IM1401)液体室温3：鞘液(No.8546859)液体20L室温4：清洗液(No.8546930)液体5L室温5：荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8(Flow-Check)仪器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra样本制备：1)

5、按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）6)需要做绝对计数的指标，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count(务必做到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Cou

6、nt，而且加完即上机)报告结果报告百分数（和绝对值）操作性能精密度批内五次重复CV10.0109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核细胞。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体28(CD3/HLA-DRNo.IM1295CD25-PC5No.IM2646CD3-FITCNo.IM1281CD45RA-PENo.IM1834CD45RO-PENo.IM1307CD4-PC5No.IM2636）2：全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温(OptilyseC

7、No.IM1401)液体室温3：鞘液(No.8546859)液体20L室温4：清洗液(No.8546930)液体5L室温5：荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8(Flow-Check)仪器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra样本制备：1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行

8、溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）报告结果报告百分数操作性能精密度批内五次重复CV5-10%提示排斥、持续增加提示应作病理活检；CD3+/HLA-DR+增加5-10%但不伴CD25增加提示MCV感染。2.正常机体内各种T细胞之间以及与其他免疫细胞之间在数量上保持一定比例，如果它们之间比例失调就会引起免疫功能紊乱，将导致机体免疫力下降和感染性疾病、自身免疫病、肿瘤等疾病的发生，检测淋巴细胞各种亚群有助于疾病的诊断、预后和治疗。CD45RA、CD45RO均为T细胞的辅助分子，C

9、D45RA+纯真型T细胞当免疫力下降时减少；CD45RO+记忆型T细胞对第二次抗原刺激极其敏感，通常在急性感染疾病中增加，在慢性感染疾病中减少。方案（Protocol）同淋巴细胞亚群检测结果（Result）HLA-B27测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集

10、部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1样本量1ml。2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。3样本白细胞计数应在4.0-10.0109/L之间。若10.0109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核细胞。4溶血样本不能用。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体1ML28(HLA-B27/HLA-B7No.IM1502同型对照IgG1IgG2aNo.IM1389)2：全血溶血试剂液体A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温3：鞘液液体20L室温4：清洗液液体5L室温5：荧光微球液体10ML2-8质控

11、品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra样本制备：1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITCIgG1-PE)2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示RE

12、ADY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)洗、离心、上机测样（备注：测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）报告结果报告阴阳性操作性能精密度批内五次重复CV90%。临床意义HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。HLA-B27基因属于?型MHC基因，所有有核细胞上均有表达，尤其是淋巴细胞表面含量丰富，人们发现HLA-B27抗原表达与强直性脊柱炎有高度的相关性，超过90%

13、的强直性脊柱炎患者HLA-B27抗原表达阳性，而正常人群中仅5-10%的认为阳性。由于强直性脊柱炎症状与许多疾病相类似，临床上难以确诊，因此HLA-B27检测在疾病的诊断中具有重要意义，HLA-B27的检测是该疾病诊断和鉴别诊断中的一个重要指标。方案（Protocol）1.选参数点击点击键入文件名，点击Save2.画图结果1.positive(+)X-Mean=17.12.negative(-)X-Mean=1.2X-Mean=5.8CD55/CD59测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双色直接免疫荧光法。近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分

14、子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1样本量1ml。2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。3溶血样本不能用。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体1ML28(CD59-FITCNo.IM3457CD55-PENo.IM2726)2：全血溶血试剂液体A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C

15、：多聚甲醛液体14ML室温3：鞘液液体20L室温4：清洗液液体5L室温5：荧光微球液体10ML2-8质控品BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra样本制备:(一)白细胞CD55CD59检测1准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。分别向二管中加入样品100ul。2溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进

16、行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）3离心后分别加入CD55/CD5910ul和相应的同型对照10ul。避光20-30分钟。4洗涤离心5上机测样(二)红细胞CD55CD59检测1准备2支流式细胞仪专用管，分别标记2分别加入CD55CD5910ul和相应的同型对照10ul。3向二管中加入1：200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光20-30分钟。4洗涤离心。5混匀、上机测样。报告结果报告百分数操作性能精密度批内五次重复CV97%CD5997%PNH的临界值：RBCCD5995%WBCCD5990%PNH

17、的诊断值：RBCCD5991%大部分80%中性粒细胞CD5984%临床意义用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。方案（Protocol）(同HLA-B27)结果1.RBC:normal2.RBC:abnormal3.WBC干细胞检测和绝对计数方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与干细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常

18、状态。采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1样本量1ml。2样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。3样本白细胞计数应在4.0-10.0109/L之间。若10.0109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核细胞。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体28(CD34No.IM1871CD45-PC5No.IM2653/IM2652Flow-Count荧光微球No.7547053)2：全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温(Optily

19、seCNo.IM1401)液体室温3：鞘液(No.8546859)液体20L室温4：清洗液(No.8546930)液体5L室温5：荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8(Flow-Check)仪器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra样本制备：1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行

20、溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)需要做绝对计数时，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count(务必做到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count，而且加完即上机)6)上机测样报告结果报告百分数（和绝对值）操作性能精密度批内五次重复CV10.0109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核细胞。试剂品牌剂型规格贮存贝克曼库尔特成分1：单克隆抗体液体28(CD34No.IM1871CD45-PC5No.IM2653/IM2652Flow-Count荧光微球No.7547053)2：

21、全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)A：甲酸液体70ML室温B：碳酸钠等液体32ML室温C：多聚甲醛液体14ML室温(OptilyseCNo.IM1401)液体室温3：鞘液(No.8546859)液体20L室温4：清洗液(No.8546930)液体5L室温5：荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8(Flow-Check)仪器BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra操作-样本制备：细胞膜表面抗原1首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。2首先每管中加入5ulCD45-PC5抗体。3然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul(注意：必

22、须是FITC和PE标记的抗体搭配)4各管中加入标本(骨髓或外周血)30100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光2030分钟。5溶血：a.OptiLyseC(按说明书步骤溶血)b.使用COULTERQPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）细胞浆和核抗原1准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。2首先每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定)，5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分

23、钟。3每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。4各管中加入PBS4ml。5300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。(1500r/min*5min)6各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。7加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。8各管中加入4mlPBS，振荡混匀。9300g离心5分钟后，弃去上清液。10各管中加入PBS500ul，振荡混匀。11上机测样报告结果报告百分数操作性能精密度批内五次重复CV2参考值CD34+5%MPO+5%粒系20%淋系10.0109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若4.0109/L，应分离单个核细胞。4溶血样本不能用。