实验5 氨基酸类物质的紫外光谱分析和定量测定.docx

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实验5氨基酸类物质的紫外光谱分析和定量测定

氨基酸类物质的紫外光谱分析和定量测定

张明铉PB15030833

开课实验室：

环境资源楼312

【实验目的】

1、掌握紫外分光光度法的分析原理与基本操作，熟悉紫外分光光度计的结构及特点，掌握其使用方法。

2、学习紫外–可见吸收光谱的绘制及定量测定方法。

3、了解氨基酸类物质的紫外吸收光谱的特点。

【基本原理】

•原理概述：

紫外光谱等物质的吸收光谱可以反映物质在不同的光谱区域内吸收能力的分布情况，不同的物质因分子结构不同，吸收光谱也不同，可以从波形、波峰的强度、位置及其数目反映出来，因此，吸收光谱带有分子结构与组成的信息。

•紫外分光光度法：

类型：

吸收光谱法。

原理：

电子的跃迁：

电子由于受到光、热、电等的激发，从一个能级转移到另一个能级的现象。

这是因为分子中的电子总是处在某一种运动状态中，每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。

当这些电子吸收了外来辐射的能量，就从一个能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级。

作图原理：

物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，如果改变通过某一吸收物质的入射光的波长，并纪录该物质在每一波长处的吸光度A,然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，这样得到的谱图为该物质的吸收光谱或吸收曲线；

定量关系：

当一定波长的光通过某物质的溶液时，入射光强度I0与透过光强度It之比的对数与该物质的浓度c及厚度b成正比。

其数学表达式，即Lambert-Beer定律，为：

这是是分光光度法定量分析的基础，T为透光率（比）。

仪器构造：

图1紫外分光光度计仪器简图

•氨基酸：

定义：

含有氨基和羧基的有机物，是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位。

光学性质：

对光有吸收作用。

20种氨基酸在可见光区域均无光吸收，在远紫外区（<220nm）均有光吸收，在（近）紫外区（220nm—300nm）只有三种氨基酸有光吸收能力（苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）），因为它们的结构均含有含有苯环共轭双键系统。

苯丙氨酸最大吸收波长在259nm、酪氨酸在278nm、色氨酸在279nm，蛋白质一般都含有这三种氨基酸残基，所以其最大光吸收在大约280nm波长处，因此能利用紫外分光光度法很方便的测定蛋白质的含量。

【仪器与试剂】

1、仪器：

紫外-可见-近红外分光光度计（UV-3600或UV-2401）；

0.5mL、1.0mL、2.0mL移液管若干；

10mL带塞比色管若干；

2、试剂：

标准溶液（a）：

100mg/L的酪氨酸溶液；

标准溶液（b）：

100mg/L的色氨酸溶液；

标准溶液（c）：

1000mg/L的苯丙氨酸溶液（所有溶液均用去离子水配制）；

酪氨酸待测样。

【实验步骤】

1.分别移取标准溶液（a）（100mg/L，2.0mL）、标准溶液（b）（100mg/L，1.0mL）和标准溶液（c）（1000mg/L，1.0mL）标准溶液于10mL比色管中，用去离子水稀释、定容、摇匀，待用；

2.分别移0.25、0.5、1.0、1.5、2.0mL标准溶液（b）于5个10mL比色管中，并用去离子水稀释、定容，摇匀，待用；

3.打开UVProbe软件界面，点左下角“连接”，系统开始自检，等系统自检结束。

预热15-30分钟。

待仪器稳定后方可使用；

4.在光谱测量模式下，设置仪器参数：

波长范围200—600nm，扫描速度：

快速；测样间隔：

0.2nm；狭缝宽度：

1.0nm，以去离子水为参比溶液，分别绘制步骤

（1）中各溶液在200～600nm波长范围内的吸收光谱。

并记录各标准溶液的λmax；

5.在定量测定模式下，以去离子水为参比溶液，测定步骤

（2）中的各标准溶液在λmax处的吸光度；

6.在步骤5同样条件下，测定未知样品溶液在λmax处的吸光度；

7.绘制标准溶液一至四阶导数，求出酪氨酸为零而色氨酸不为零的值，选出合适的导数，将所有图像都求该阶导数；

8.拟合标准曲线，求出待测样中各物质含量。

【数据处理与实验结果分析】

1.绘制三种氨基酸的紫外吸收光谱

实验时设置的扫描波长为200—600nm，但实际的光谱图中只有350nm以下才有吸收峰，故作图的波长范围为200-350nm。

图2苯丙氨酸紫外吸收光谱

可以看到苯丙氨酸在波长接近200nm时吸收强度突然升高，但仍可以看到在215nm处有一个强吸收峰，在258nm处有一个弱吸收峰，但由于强吸收峰吸收强度过强，弱吸收峰看不太出来，经过放大后可以明显看到。

图3苯丙氨酸紫外吸收光谱将258nm左右的吸收峰放大

图4色氨酸紫外吸收光谱

可以看出色氨酸在279nm附近左右有最大吸收波长，另外在218nm附近也有强吸收峰。

图5酪氨酸紫外吸收光谱

可以看出酪氨酸在276nm附近左右有最大吸收波长，另外在223nm附近也有强吸收峰。

将苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸溶液的吸收光谱叠加在一个坐标系中，比较它们的吸收峰的变化：

图6三种氨基酸紫外吸收光谱比较

比较最大吸收波长（>220nm的吸收峰）：

色氨酸（279nm）>酪氨酸（276nm）>苯丙氨酸（258nm）。

结果分析：

·如图7所示，由于三种氨基酸的结构均含有含有苯环共轭双键系统。

苯丙氨酸最大吸收波长在258nm、酪氨酸在276nm、色氨酸在279nm。

图7三种氨基酸结构

·三种氨基酸均具有苯环、吲哚环等大的不饱和基团，其中具有吲哚基团的色氨酸的不饱和键数量及其面积最大，故发生红移，具有最大的吸收波长，大于苯丙氨酸和酪氨酸的波长（苯丙氨酸有4个共轭双键，而色氨酸有5个共轭双键）；而酪氨酸中的羟基存在给电子共轭效应，其相对苯丙氨酸发生了红移，最大吸收波长也大于苯丙氨酸。

从共轭角度看，体系的共轭度增强，波长红移。

·对于吸收强度，因为共轭体系π→π*跃迁所产生的吸收带的吸收强度大，摩尔吸收系数εmax>10000L·mol-1·cm-1，三种氨基酸均有π→π*跃迁，而酪氨酸还有n→π*跃迁（不过这种跃迁的吸收强度小），所以最大吸收峰处的吸收强度苯丙氨酸较小，但总体差别不大。

2.绘制色氨酸和赖氨酸溶液的一至四阶吸收光谱：

要求当干扰物质酪氨酸的纵坐标数值绝对值小于0.001。

图8色氨酸（绿）和酪氨酸的一阶导数

可以看到当酪氨酸导数为零时色氨酸较大的导数值与对应波长为：

（221.96，-0.838）

图9色氨酸（紫）和酪氨酸的二阶导数

可以看到当酪氨酸导数为零时色氨酸较大的导数值与对应波长为：

（230.80，0.163）

图10色氨酸（黄）和酪氨酸的三阶导数

可以看到当酪氨酸导数为零时色氨酸较大的导数值与对应波长为：

（224.74，0.069）

3.工作曲线绘制

图11各浓度标准溶液和未知溶液一阶导数曲线

·最后选定用一阶导数来作工作曲线。

将配制的各标准色氨酸溶液的光谱在221.96nm处的值为纵坐标，相应的浓度为横坐标绘制工作曲线，再根据未知溶液的吸光度，利用标准曲线求出待测样浓度。

（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准溶液（b）100mg/L的色氨酸溶液稀释至10mL，对应浓度分别为2、4、6、8、10mg/L）

图12工作曲线

·得到工作曲线如图11，得到吸收值一次导数与溶液浓度的关系I=-0.08015c-0.0139，相关系数R2=0.99361，线性拟合较好。

·未知溶液的紫外吸收光谱一阶导数在221.96nm处的值为-0.425，带入工作曲线方程得到未知溶液中色氨酸浓度为：

5.129mg/L。

【思考题】

1、导数光谱法应用于定量的方法有哪些？

请详述。

答：

导数光谱法是解决干扰物质与被测物质的吸收光谱互相重叠、消除胶体和悬浮物散射影响和背景吸收以及提高光谱分辨率的一种技术。

符合L-B定律的吸收光谱都可以通过导数光谱法减小误差影响，在本实验中的新型紫外光谱仪，以及旧型的分光光度计均可使用导数光谱法，定量测量混合溶液中某组分的浓度。

2、吸收光谱的影响因素有哪些？

答：

有如下影响因素

（1）共轭效应：

具有至少一个芳环或多个共轭双键的物质在近紫外区域才有吸收，共轭面积越大，波长越大；

（2）取代基的性质：

芳环上的取代基会引起吸收峰的改变，给电子基（-OH、-NH2）会使最大吸收波长红移；吸电子基（-NO2、-Cl）会使使最大吸收波长蓝移；

（3）溶剂的影响：

一般溶剂极性增大，π-π*跃迁吸收带红移，n-π*跃迁吸收带蓝移。

溶剂极性越大，分子与溶剂的静电作用越强，使激发态稳定,能量降低。

即π*轨道能量降低大于π轨道能量降低，因此波长红移。

而产生n-π*跃迁的n电子由于与极性溶剂形成氢键，基态n轨道能量降低大，n-π*跃迁能量增大，吸收带蓝移。

；

（4）pH的影响：

例如酚羟基、氨基等在不同酸碱性下会有不同的存在形式：

酚羟基在碱性条件下变为-O-，给电子能力加强，使最大吸收波长红移；-NH2在酸性条件下变为-NH3+，从给电子基团变为吸电子基团，使最大吸收波长蓝移。

3、如何测量氨基酸中酪氨酸的含量，请写出详细的实验步骤

答：

与本实验的思路相似，步骤刚好相反，大致步骤如下：

（1）分别移0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL酪氨酸标准溶液于5个10mL比色管中，并用去离子水稀释、定容，摇匀，待用；

（2）打开仪器，预热、校零、设置仪器参数（同本实验）；

（3）分别绘制步骤色氨酸和赖氨酸在200～350nm波长范围内的吸收光谱。

并记录各标准溶液的λmax；

（4）定量测定模式下，以去离子水为参比溶液，测定步骤

（2）中的各标准溶液在λmax处的吸光度；绘制色氨酸和赖氨酸溶液的一至四阶吸收光谱，要求当干扰物质色氨酸的纵坐标数值绝对值小于0.001：

（5）在步骤4同样条件下，测定未知样品溶液在λmax处的吸光度，从而得到酪氨酸的浓度

4、本实验是采用紫外吸收光谱中波长最大的吸收峰下进行测定的，是否可以在另外两个吸收峰下进行定量测定，为什么？

答：

因为本实验光谱中波长最大的吸收峰是共轭环（苯环或吲哚环）发生π→π*跃迁的B吸收带，在实验中，被测物的共轭体系只与氨基酸的浓度有关，所以用B吸收带的吸收强度可以测出氨基酸的浓度，无干扰。

而在其他吸收峰中，由于溶液电离作用等的影响，n→π*跃迁的R吸收带受影响较大，不能用其吸收强度准确计算出苯酚的浓度。

5、被测物浓度过大或过小对测量有何影响？

应如何调整？

调整的依据是什么？

答：

浓度过大：

可能超过量程,并且吸光度越大,会导致整个浓度-吸光度曲线偏离L-B定律的直线范畴,不易拟合,误差越大；需要稀释至线性范围后再重新测量；

浓度过小：

会超过检测器的灵敏度,由于信噪比等影响检测不出准确的吸光度，同样影响准确性，通过适当蒸发或者使用更精密的仪器测量。

二者调整的依据都是Lambert-Beer定律，即入射光强度I0与透过光强度It之比的对数与该物质的浓度c成正比。

6、思考紫外-可见分光光度法应用于蛋白质测量的依据，并设计相应的实验方案，测定奶粉中蛋白质的含量。

答：

由于本实验测量的三种氨基酸的结构均含有含有苯环共轭双键系统。

苯丙氨酸最大吸收波长在259nm、酪氨酸在278nm、色氨酸在279nm，蛋白质一般都含有这三种氨基酸残基，所以其最大光吸收在大约280nm波长处，因此能利用分光光度法很方便的测定蛋白质的含量。

在测量等梯度的蛋白质溶液的紫外吸收曲线，作出工作曲线，通过L-B定律得出奶粉中的蛋白质含量。

另外，由于蛋白质在碱