医学答辩：1 - 医学毕业论文答辩.pptx

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医学医学毕业论毕业论文答文答辩辩Genistein后后处处理介理介导导大鼠海大鼠海马马CA1区区eNOS/Nrf2/HO-1信号通路及其神信号通路及其神经经保保护护作作用用研研究究生：

生：

XXX导导师师：

XX教教授授2020研究的背景及研究的背景及意意义义材料与方材料与方法法实验结实验结果与果与讨讨论论123目目录录CONTENTS总总结结致致谢谢45不足与展不足与展望望6第一部分第一部分研究的背景及意研究的背景及意义义PART0101研究的背景及意研究的背景及意义义对缺血性脑中风发病机制及防治的研究已成为医学界关注的重点。

缺血大脑迅速获得血液供应是阻止缺血性神经元损伤的首要措施，然而，大量的血液迅速再灌注又进一步加重缺血组织的损伤-即缺血再灌注损伤。

氧化应激和炎症是缺血再灌注损伤病理生理机制的重要组成部分。

脑缺血再灌注早期即有大量活性氧产生，并迅速启动损伤级联，加剧了初始损害最终导致神经元不可逆的损伤。

因此，再灌注早期阻断氧化应激损伤是有效降低迟发性神经元死亡的关键。

研究的背景及意研究的背景及意义义Genistein具有酪氨酸激酶抑制剂活性和抗氧化作用。

4Genistein作为酪氨酸激酶抑制剂可有效减弱短暂全脑缺血造成的神经元5的延迟性死亡；一个单纯的氧诱导的脑缺血小鼠模型显示Genistein具有抗氧化活性。

eNOS活性的升高对脑中风具有有益作用。

另研究发现，Genistein能够诱导eNOS活性并激活核因子NF-E2相关因子（Nrf2），进而诱导抗氧化酶表达、减少心血管疾病的发生。

6那么，Genisteinpostconditioning（GPC，即缺血后给予Genistein）是否能通过eNOS/Nrf2/ARE信号通路降低氧化应激，从而发挥抗缺血性神经元损伤的作用？

目前尚未见报道。

本研究采用四本研究采用四动动脉脉结结扎扎（4-VO）全全脑脑缺血模缺血模型，型，观观察察GPC对对缺血性神缺血性神经经元的保元的保护护作用，并探作用，并探讨讨其其可能的分子机制，可能的分子机制，为临为临床防治缺血性床防治缺血性脑脑中中风风提供提供理理论论依据。

依据。

研究的背景及意研究的背景及意义义第二部分第二部分材料与方法材料与方法PART0202大鼠脑立体定位仪大鼠脑微量注射泵冰冻切片机激光扫描共聚焦显微镜酶标仪电泳设备摇床Morris水迷宫超低温冰箱等组织裂解液BCA蛋白浓度测定试剂盒eNOS、p-eNOS、Nrf2、HO-1一抗及其相应的二抗NBT/BCIP显色液NeuN、4-HNE、8-OHdG一抗及对应的荧光二抗TUNEL试剂盒材料与方法材料与方法SPF级成年雄性SD大鼠随机分组及4-VO模型ShamI/RVeh1（IR+DMSO）GPCVeh2（GPC+NaCl）L-NAME24hI10mI10mI10m30mI10mI10m30m6h1d5d椎椎动动脉脉电电凝并分离凝并分离颈总动颈总动脉脉侧脑侧脑室注射室注射L-NAME1mg/5l缺缺血血0.9%NaCl尾静脉注射尾静脉注射Genistein1mg/kg0.1%DMSO3d7d9d材料与方法材料与方法再灌注再灌注5d检检测测海海马马CA1区神区神经经元元的凋亡及存的凋亡及存活活实验实验方法及方法及检测检测指指标标再灌注再灌注30min,6h,1d,3d观观察察p-eNOS,Nrf2,HO-1蛋白表蛋白表达达蛋白免蛋白免疫疫印迹技印迹技术术TUNEL染染色色及及NeuN染染色色免疫免疫荧荧光光染色染色法法再灌注再灌注3d观观察察海海马马CA1区区神神经经元元8-OHdG,4-HNE,Nrf2,HO-1蛋白蛋白的的表达及定表达及定位位Morris水迷水迷宫宫再灌注再灌注7-9d，检测检测大鼠的空大鼠的空间间学学习习和和记忆记忆能能力力材料与方法材料与方法数据整理后，应用SigmaStat3.5统计软件进行统计学分析。

所有计量资料数值以均数标准差表示，采用单因素方差分析（ANOVA），多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法（LSD），各各实实验验组组之之间间比比较较采采用用q检验检验（Newman-keulstest），P0.05为为差异有差异有统计统计学意学意义义。

材料与方法材料与方法第三部分第三部分实验结实验结果与果与讨论讨论PART0303图AB1、NeuN及TUNEL免疫荧光染色观察再灌注5d大鼠海马CA1区神经元的存活及凋亡C实验结实验结果与果与讨论讨论图图A：

NeuN（红红色色）染色染色：

生存的神：

生存的神经经元；元；TUNEL（绿绿色色）染色：

染色：

凋凋亡亡样样神神经经元；元；图图B：

海：

海马马CA1区区1mm长长度内度内NeuN阳性神阳性神经经元数元数量量统计图统计图；图图C：

海：

海马马CA1区区1mm长长度度内内TUNEL阳性神阳性神经经元数量元数量统统计计图图;*P0.05vs.I/R组组，#P0.05vs.GPC组组，n=5;40,bar=50m小小结结1Genistein后处理对缺血性神经元损伤具有保护作用，eNOS激酶抑制剂L-NAME减弱了该作用，说明eNOS可能参与了此保护作用。

Genistein后后处处理是否理是否诱导诱导eNOS激活（磷酸化激活（磷酸化）?

实验结实验结果与果与讨论讨论图2GPC对大鼠海马CA1区神经元eNOS、p-eNOS蛋白表达的影响图图A：

再灌注不同：

再灌注不同时间时间点点p-eNOS、eNOS蛋白的表达；蛋白的表达；Sh：

Sham组组；R：

再灌注；：

再灌注；：

I/R组组；：

GPC组组；GPC:

Genistein后后处处理；理；图图B：

p-eNOS蛋白表达蛋白表达统计图统计图：

n=4；*p0.05vs.I/R组组AB实验结实验结果与果与讨论讨论AB实验结实验结果与果与讨论讨论图3L-NAME对再灌注3d大鼠海马CA1区神经元eNOS磷酸化水平的影响图图A：

各：

各实验组实验组再灌注再灌注3dp-eNOS蛋白表达；蛋白表达；图图B：

各：

各实验组实验组再灌注再灌注3dp-eNOS蛋白表达蛋白表达统计图统计图，n=5，*p0.05VS.I/R组组；#p0.05VS.Vehicle2组组小小结结2Genistein后后处处理理可可诱诱导导全全脑脑缺缺血血大大鼠鼠海海马马CA1区区eNOS磷磷酸酸化化水水平平升升高高，eNOS激激酶酶抑抑制制剂剂L-NAME可可有有效效降降低低GPC诱诱导导的的eNOS磷磷酸酸化化水水平。

平。

结结果揭示：

果揭示：

eNOS磷酸化水平升高参与了磷酸化水平升高参与了Genistein的神的神经经保保护护作用。

作用。

Genistein后后处处理是否能有效降低缺血再灌注后神理是否能有效降低缺血再灌注后神经经元的氧化元的氧化应应激激损伤损伤呢呢?

4-HNE是脂是脂质过质过氧化的最氧化的最终产终产物物，被公被公认为认为氧化氧化应应激最激最稳稳定的定的标记标记物物8-OHdG，是，是DNA氧化氧化损伤损伤的特的特异异产产物物实验结实验结果与果与讨论讨论图4GPCI/RA全脑缺血再灌注3d，各实验组大鼠海马CA1区4-HNE及8-OHdG免疫荧光染色BGPCI/R图A：

绿色:

NeuN；红色:

4-HNE；图B：

红色:

DAPI；绿色:

8-OHdG；n=4-5；40；bar=50m实验结实验结果与果与讨论讨论小小结结3GPC能有效降低氧化能有效降低氧化应应激激损伤损伤；eNOS激激酶酶抑制抑制剂剂L-NAME废废除了此神除了此神经经保保护护作用作用。

Nrf2/ARE信号是生物体内抗氧化应激反应最重要的内源性防御系统。

那么，GPC是否通过eNOS诱导了此信号通路?

实验结实验结果与果与讨论讨论C图5A-C图图A：

再再灌灌注注不不同同时时间间点点核核内内Nrf2蛋蛋白白表表达达；图图B：

再再灌灌注注不不同同时时间间点核内点核内Nrf2蛋白蛋白表表达达统计图统计图，n=4，*p0.05vs.I/R组组；图图C：

再灌注再灌注3d各各实实验组验组Nrf2蛋白的表达蛋白的表达及及统计图统计图；*p0.001vs.I/R组组，#p0.001vs.Vehicle2组组GPC促进大鼠海马CA1区Nrf2蛋白表达A实验结实验结果与果与讨论讨论神经元内Nrf2的表达及定位绿绿色：

色：

Nrf2；红红色色:

NeuN；黄色：

黄色：

二者的共定位；二者的共定位；40；bar=30图图5D免疫荧光染色法观察大鼠再灌注3d海马CA1区m.L-NAME实验结实验结果与果与讨论讨论图图6大鼠再灌注3d海马CA1区神经元内HO-1蛋白表达及其与Nrf2的共定位图图A-B：

HO-1蛋白表达及其蛋白表达及其统计图统计图；图图C：

HO-1与与Nrf2蛋白的共定位，蛋白的共定位，*p0.05VS.I/R组组；#p0.05VS.vehicle2组组；绿绿色：

色：

Nrf2；红红色：

色：

HO-1；蓝蓝色：

色：

DAPI；合成；合成图图为为三者的共定位三者的共定位；40；n=4-5；bar=50m；CL-NAMEShamI/RGPCVehiclLe-2NAMEHO-1NeuNA实验结实验结果与果与讨论讨论小小结结4实验结实验结果与果与讨论讨论海海马马是学是学习习和和记忆记忆的重要部位，而海的重要部位，而海马马CA1区是缺血最敏感区是缺血最敏感的的区域。

那么，区域。

那么，GPC是否能改善大鼠缺血后空是否能改善大鼠缺血后空间间学学习记忆习记忆能力能力?

GPC可显著增加海马CA1区神经元胞核中Nrf2蛋白的表达并引起下游靶基因HO-1的表达，而L-NAME阻断了此作用。

此结果进一步揭示GPC通过eNOS诱导了Nrf2/HO-1抗氧化信号通路，从而阻断了缺血再灌注后迟发性神经元损伤。

图图7GPC对对大鼠缺血后空大鼠缺血后空间间学学习习和和记忆记忆能力的影响能力的影响图图A-B：

潜潜伏伏实实验验和和探探索索实实验验统统计计图图；n=5；*p0.05vs.I/R组组；#p0.05vs.GPC组组.图图C-D：

潜伏潜伏实验实验和探索和探索实验实验大大鼠鼠游泳路程游泳路程轨轨迹迹图图DC实验结实验结果与果与讨论讨论实验结实验结果与果与讨论讨论小小结结5GPC能有效的改善大鼠缺血后的空间学习和记忆能力。

第四部分第四部分总总结结04PART04GPC对对缺血性神缺血性神经经元元损伤损伤具有保具有保护护作用作用。

GPC能有效改善大鼠短能有效改善大鼠短暂暂全全脑脑缺血后的缺血后的认认知功能知功能。

GPC可通可通过诱导过诱导eNOS磷酸化水平并上磷酸化水平并上调调Nrf2/HO-1信号通路信号通路，从而降低从而降低脑脑缺血缺血诱导诱导的氧化的氧化应应激激损伤损伤。

020301总结总结第五部分第五部分不足与展望不足与展望PART0505不足与展望不足与展望GPC是否可增加是否可增加Nrf2的的DNA结结合活性有待合活性有待进进一步研究。

一步研究。

GPC是否也触是否也触发发了其它促生存信号了其它促生存信号转导转导通路通路（如如雌雌激激素素受受体体信信号号），从从而而起起到到抗抗缺缺血血性性神神经经元元损损伤伤的的作作用用。

其其确确切切的的机机制制还还有有待待多多层层面、多角度的面、多角度的进进一步探究一步探究。

第四部分第四部分致致谢谢04PART04致致谢谢实验实验和和论论文的最文的最终终完成是我的完成是我的导师导师*教授精心指教授精心指导导的的结结果。

果。

谨借此机会，向我敬爱的恩师表示最衷心的感谢！

感谢河北联合大学研究生学院、基础医学院病理教研室以及形态中心的各位老师所给予我的指导、关心与包容！

感谢在学习及生活中曾经与我朝夕相处、共同努力、不懈追求的同学和朋友们！

感谢我的父母、亲人和工作单位对我的支持与鼓励，正是他们的理解和关怀使我顺利的完成学业！

医学医学毕业论毕业论文答文答辩辩Genistein后后处处理介理介导导大鼠海大鼠海马马CA1区区eNOS/Nrf2/HO-1信号通路及其神信号通路及其神经经保保护护作作用用研研究究生：

生：

XXX导导师师：

XX教教授授2019