部分修改酶工程实验权春善.docx
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部分修改酶工程实验权春善
实验一紫外吸收法测定蛋白质含量
一、实验目的
学会用紫外吸收法测定蛋白质含量的方法。
二、实验仪器
紫外分光光度计
三、实验原理
大多数蛋白质由于有酪氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm有吸收高峰，可以进行蛋白质含量的测定。
但是核酸在280nm也有吸收，干扰测定，不过核酸的最大吸收峰在260nm，warburg等测定了酵母烯醇酶和酵母核酸在280nm和260nm时吸光值（A）的比值，然后通过计算消除核酸存在的影响，可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度。
该方法是以酵母烯醇酶蛋白和酵母核酸为标准建立计算公式，而不同蛋白质的氨基酸组成也不同，因而光吸收也不尽相同，这就会带来一定的误差。
四、方法步骤
1．取待测样品溶液置于光径1cm的石英比色杯中，于紫外分光光度计波长280nm和260nm，分别读取A280和A260，用蒸馏水（缓冲溶液或盐溶液，视样品溶液而定）为比色空白对照。
2．根据下列公式计算样品中的蛋白质含量。
蛋白质含量（mg/ml）=1.55A280—0.76A260
五、实验报告
计算所测材料蛋白质的含量。
六、思考题
1．测定蛋白质含量的方法有哪些，它们所根据的原理是什么？
2．试比较测定蛋白质含量的几种方法的优缺点。
实验二蛋白酶活性的测定方法
一、实验目的
（1）了解蛋白酶活力测定的原理
（2）掌握蛋白酶活性的测定方法。
二、实验原理
蛋白酶在一定的条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活性。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶水解后，降解成相对分子量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
在275nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可以计算出酶的活力。
三、实验试剂
1.1%酪蛋白溶液：
2.10%三氯醋酸（TCA）溶液：
四、实验步骤
1.酶活定义：
在温度40℃pH7.5条件下，每分钟水解酪蛋白生成lμg酪氨酸所需的酶量为一个活力单位。
2.活性测定步骤：
（1）将10%的三氯醋酸和1mL1%的酪蛋白溶液在40℃中保温。
（2）取2支试管，分别标记成B0和S。
（3）在B0试管中加入lmL样品（酶）溶液，40℃保温10min，加入三氯乙酸溶液4mL，在室温下静置10min，立即加入酪蛋白溶液1mL，摇匀，离心，收集上清液。
（3）在S试管中加入1mL酶液。
量取1mL在40℃中保温的1%的酪蛋白溶液，迅速加入至试管中混匀，于40℃反应10min，加入4mL10%的三氯乙酸终止反应，摇匀，离心，弃沉淀，留上清。
（4）在275nm波长下，以B0为空白，测定S上清液的吸光度。
注意：
比色皿用石英比色皿，不能用玻璃比色皿。
标准曲线的绘制：
不同浓度的L-酪氨酸标准溶液的配置如表1所示，直接用紫外分光光度计测定其吸光度A275nm，以吸光度为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（通过零点），根据作图或者用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值（应在130-135范围内）。
表1标准曲线的绘制
管号
酪氨酸标准溶液的浓度
（μg/ml）
取100μg/ml酪氨酸标准溶液的体积（ml）
取水的体积
（ml）
0
0
0
10
1
10
1
9
2
20
2
8
3
30
3
7
4
40
4
6
5
50
5
5
酶活力计算公式：
U/mL=A×K×6/1/10×n×E
A：
样品的平均吸光度
K：
吸光常数
6：
反应试剂总体积（mL）
1：
吸取酶液1mL
10：
反应时间10min
n：
稀释倍数
E：
紫外法与folin法的换算倍数（中性、碱性蛋白酶系数为0.50；酸性蛋白酶系数为0.77）
实验三酶活性的修饰实验
一、实验目的
（1）学习和掌握酶分子的化学修方法。
（2）了解化学修饰对酶活性的影响。
二、实验原理
酶分子中的许多侧链基团可以被化学修饰。
这种修饰可以帮助了解哪些基团是保持酶活性所必需的，哪些基团对维持酶的催化反应并不重要。
当化学修饰试剂与酶分子上的某种测链基团结合后，酶的活性降低或者丧失，表明这种被修饰的残基是酶活性所必需的。
反之亦然。
酶分子中有许多基团可被共价化学修饰，如巯基、羟基、咪唑基、胍基、氨基和羧基等。
可以用来进行化学修饰的试剂也很多，如5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）和N-乙酸马酰亚胺（NEM）是巯基的修饰剂，可以用来鉴定半胱氨酸残基是否是酶活性所必需的。
磷酸吡哆醛可以与赖氨酸残基起反应；2,3-丁二酮则可以和精氨酸残基起反应。
本实验以木瓜蛋白酶为材料，分别以DTNB和、磷酸吡哆醛为化学修饰剂，研究木瓜蛋白酶活性所必需的残基。
三、实验仪器与试剂
1.实验设备：
恒温水浴、紫外可见分光光度计
2.木瓜蛋白酶溶液：
用0.01mmol/L磷酸缓冲液配制，浓度10mg/mL。
3.DTNB（2-硝基苯甲酸）：
浓度配制成0.40mmol/L
4.磷酸吡哆醛：
浓度配制成4mmol/L
5.0.01mmol/L磷酸缓冲液（pH7.5）：
6.5mg/mL半胱氨酸
7.5mg/mL赖氨酸
四、实验步骤
1.分别用DTNB、磷酸吡哆醛对木瓜蛋白酶进行修饰。
2.取6支带盖试管，按表1量取DTNB、去离子水、木瓜蛋白酶。
表1：
利用DTNB化学试剂修饰木瓜蛋白酶
管号
0.4mMDTNB（mL）
去离子水（mL）
酶液（mL）
1
2.0
0
2.0
2
2.0
0
2.0
3
1.0
1.0
2.0
4
1.0
1.0
2.0
5
0
2.0
2.0
6
0
2.0
2.0
混匀，37°C暗处反应30min，加入0.2mL半胱氨酸，混匀，终止反应。
取1mL反应液，按照实验二中蛋白酶活性的测定方法测定木瓜蛋白酶的活性。
以不加DTNB修饰剂的酶活力为100%。
3.取6支带盖试管，按表1量取磷酸吡哆醛、去离子水、木瓜蛋白酶。
表1：
利用DTNB化学试剂修饰木瓜蛋白酶
管号
4M磷酸吡哆醛（mL）
去离子水（mL）
酶液（mL）
1
2.0
0
2.0
2
2.0
0
2.0
3
1.0
1.0
2.0
4
1.0
1.0
2.0
5
0
2.0
2.0
6
0
2.0
2.0
混匀，37°C暗处反应30min，加入0.2mL赖氨酸，混匀，终止反应。
取1mL反应液，按照实验二中蛋白酶活性的测定方法测定木瓜蛋白酶的活性。
以不加磷酸吡哆醛修饰剂的酶活力为100%。
五、结果与分析
（1）以修饰剂浓度为横坐标，以残存酶活性为纵坐标，分别绘制出修饰剂浓度变化对酶活性的影响。
（2）分析木瓜蛋白酶活性所需的基团。
实验四芽孢杆菌蛋白酶的分离纯化及活力测定
一、实验目的
（1）熟悉酶试剂分离纯化的原理和方法。
（2）掌握透析和蛋白酶活力的测定方法。
（3）学习掌握离子交换层析的原理及操作。
二、实验原理
碱性蛋白酶是指在pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类，其最适pH值一般为9～11，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，除可催化蛋白质水解为氨基酸外，在有机溶剂中还可催化多肽的合成。
碱性蛋白酶广泛应用于食品、医药、洗涤剂和皮革等工业领域。
芽孢杆菌能高产具有高活力的碱性蛋白酶，被认为是商业化碱性蛋白酶的重要来源。
离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法。
离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。
目前已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。
三、实验仪器与试剂
生产菌种：
短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）
试剂、药品：
蛋白胨、酵母膏、酪蛋白、L-酪氨酸、三氯乙酸、磷酸氢二钠、氢氧化钠、盐酸、牛肉膏、葡萄糖、干酪素、葡萄糖、琼脂、NaCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、硫酸铵、EDTA纤维素等。
斜面保藏培养基（LB）：
蛋白胨1%，酵母抽提物0.5%，NaCl1%，琼脂0.5%，pH7.0.
种子培养基：
蛋白胨1%，酵母抽提物0.1%，氯化钠1%，pH7.0.
液体发酵培养基：
酪蛋白酸水解物（干酪素）1%，葡萄糖1.5%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.02%，CaCl2·2H2O0.01%，pH7.0.
离子交换层析试剂：
DEAE-纤维素。
缓冲液：
0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.5），含0.5MNaCl的磷酸缓冲液（0.01mol/L,pH7.5）
四、实验步骤
（一）蛋白酶的硫胺沉淀及透析：
1.发酵培养：
将活化好的生产菌株接入新鲜的种子培养基中，30℃，140rpm培养24h。
然后，按3%的接种量将种子培养液接种到液体发酵培养基中，30℃，140rmp，摇床培养48h。
2.粗酶液的提取：
取摇床培养48h左右的发酵液200mL，在4℃下8000r/min离心20min，取上清液，得粗酶液。
此时收集5mL样品，标记为S-1。
3.硫酸铵沉降法分离蛋白酶：
向粗酶液中加入适量硫酸铵固体，配制成饱和度为70%的硫酸铵溶液。
为提高硫酸铵的溶解速度，硫酸铵颗粒需事先用研钵研磨成细分。
边搅拌边加入硫酸铵，待硫酸铵完全溶解后再加入硫酸铵粉末。
将上述溶液于4℃下静置2小时以上。
以10,000r/min低温离心30min后收集上清液和沉淀。
此时，收集3mL上清液，标记为S-2。
沉淀用20mL磷酸缓冲液（pH7.5）溶解,待透析。
4.透析袋的预处理：
第一步：
把透析袋剪成10cm的小段。
第二步：
将透析袋放入装有的2%的碳酸氢钠和1mmol/LEDTA.2Na（pH=8.0）的溶液中（200mL）煮沸10min。
第三步：
用蒸馏水彻底清洗透析袋
第四步：
放在200mL的1mmol/LEDTA.2Na（pH=8.0）中将之煮沸10min。
第五步：
待冷却后，置于50%酒精中，放于4℃冰箱。
5.透析：
第一步：
戴上手套，用绳子先将透析袋的一侧口扎住，然后从另一侧口向里倒步骤3中得到的粗酶液，再用绳子把口扎好，放入0.01M盛有磷酸缓冲液（pH7.5）的烧杯中，烧杯里放好转子。
用透明胶把绳子头粘在烧杯壁上以免透析袋沉底。
第二步：
将烧杯放入盛满冰块的泡沫塑料盒子里，然后放到磁力搅拌机上搅拌。
第三步：
透析30-60min后，换一次烧杯内的磷酸缓冲液。
第四步：
透析结束后，将透析袋内的酶液取出，并量取其体积（？
mL）。
此时，收集3mL酶液，标记为S-3。
（二）离子交换层析法纯化蛋白酶
1.离子交换剂的制备：
称取10g阴离子交换树脂，将树脂倒入烧杯中，用0.5mol/LHCl浸泡1h。
用纯水洗树脂直到pH为中性，再用0.5mol/lNaOH浸泡1h，用纯水洗树脂直到pH为中性，再用0.5mol/LHCl浸泡1h,用纯水洗树脂直到pH为中性。
装柱前用超声波清洗机处理5min去气泡。
2.装柱：
第一步：
将柱子固定于铁架上，用铅垂校正垂直。
第二步：
加入洗脱液，打开柱出口排除气泡.待柱内剩余约2cm柱高的液柱时，关闭柱出口。
第三步：
调节离子交换剂悬液，使悬浮液与溶液之比约为3比1。
第四步：
将树脂悬液充分混合，然后一次性倾入柱内，注意此时树脂的温度与层析时的温度一致。
第五步：
待树脂自然沉降形成1-2cm高的柱后，打开出液口，直到树脂沉降到所需要的高度为止。
第六步：
柱沉降形成以后，用缓冲液液滴注平衡2-3个柱床体积，使柱床稳定，平衡时流速可稍大于层析时的流速。
还应注意保持2-3cm液柱，以防柱床干掉。
对于装好的柱，以2-5倍柱体积的起始缓冲液平衡柱体，直到流出液的pH和电导率跟缓冲液差不多。
上样：
取透析后的粗酶提取液，以2mL/min（大约2-3秒/滴）的流速上柱。
洗脱：
上样结束后，用0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）以5mL/min流速洗脱至OD280<0.02，改用含0.5mol/LNaCl的磷酸缓冲液（0.01mol/L,pH7.5）缓冲液进行洗脱至OD280<0.02。
根据吸光值，将各个峰收集并合并在一起，量体积。
每个合并液取5mL，标记为S-4,S-5等。
柱子的清洗：
（四）实验结果记录与分析
汇总所有实验结果，完成下表：
样品
体积
mL
蛋白浓度mg/mL
总蛋白mg
活力
u/mL
比活力
u/mg
总活力U
回收率
%
提纯倍数
S1
V1
100
1
S2
V2
S3
V3
其中：
总活力＝比活力×体积
回收率＝回收的样品活力占总活力的百分数
提纯倍数＝提纯的比活力与初始比活力的比值
五、思考题
1.影响硫胺沉淀及透析结果的因素有哪些？
如何避免？
2.在分离纯化蛋白酶过程中，为什么要不断的测定蛋白酶的活力和蛋白含量？
硫酸铵饱和度的常用表
1、调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25℃）
在25℃硫酸铵终浓度，%饱和度
硫
酸
铵
初
浓
度
，％
饱
和
度
10
20
25
30
33
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
90
100
每1000ml溶液加固体硫酸铵的克数*
0
56
114
144
176
196
209
243
277
313
351
390
430
472
516
561
662
767
10
57
86
118
137
150
183
216
251
288
326
365
406
449
494
592
694
20
29
59
78
91
123
155
189
225
262
300
340
382
424
520
619
25
30
49
61
93
125
158
193
230
267
307
348
390
485
583
30
19
30
62
94
127
162
198
235
273
314
356
449
546
33
12
43
74
107
142
177
214
252
292
333
426
522
35
31
63
94
129
164
200
238
278
319
411
506
40
31
63
97
132
168
205
245
285
375
469
45
32
65
99
134
171
210
250
339
431
50
33
66
101
137
176
214
302
392
55
33
67
103
141
179
264
353
60
34
69
105
143
227
314
65
34
70
107
190
275
70
35
72
153
237
75
36
115
198
80
77
157
90
79
*在25℃下，硫酸铵溶液由初浓度调到终浓度时，每升溶液所加固体硫酸铵的克数。
2、调整硫酸铵溶液饱和度计算表（0℃）
在0℃硫酸铵终浓度，%饱和度
硫
酸
铵
初
浓
度
，％
饱
和
度
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
每100ml溶液加固体硫酸铵的克数*
0
10.6
13.4
16.4
19.4
22.6
25.8
29.1
32.6
36.1
39.8
43.6
47.6
51.6
55.9
60.3
65.0
69.7
5
7.9
10.8
13.7
16.6
19.7
22.9
26.2
29.6
33.1
36.8
40.5
44.4
48.4
52.6
57.0
61.5
66.2
10
5.3
8.1
10.9
13.9
16.9
20.0
23.3
26.6
30.1
33.7
37.4
41.2
45.2
49.3
53.6
58.1
62.7
15
2.6
5.4
8.2
11.1
14.1
17.2
20.4
23.7
27.1
30.6
34.3
38.1
42.0
46.0
50.3
54.7
59.2
20
0
2.7
5.5
8.3
11.3
14.3
17.5
20.7
24.1
27.6
31.2
34.9
38.7
42.7
46.9
51.2
55.7
25
0
2.7
5.6
8.4
11.5
14.6
17.9
21.1
24.5
28.0
31.7
35.5
39.5
43.6
47.8
52.2
30
0
2.8
5.6
8.6
11.7
14.8
18.1
21.4
24.9
28.5
32.3
36.2
40.2
44.5
48.8
35
0
2.8
5.7
8.7
11.8
15.1
18.4
21.8
25.4
29.1
32.9
36.9
41.0
45.3
40
0
2.9
5.8
8.9
12.0
15.3
18.7
22.2
25.8
29.6
33.5
37.6
41.8
45
0
2.9
5.9
9.0
12.3
15.6
19.0
22.6
26.3
30.2
34.2
38.3
50
0
3.0
6.0
9.2
12.5
15.9
19.4
23.0
26.8
30.8
34.8
55
0
3.0
6.1
9.3
12.7
16.1
19.7
23.5
27.3
31.3
60
0
3.1
6.2
9.5
12.9
16.4
20.1
23.1
27.9
65
0
3.1
6.3
9.7
13.2
16.8
20.5
24.4
70
0
3.2
6.5
9.9
13.4
17.1
20.9
75
0
3.2
6.6
10.1
13.7
17.4
80
0
3.3
6.7
10.3
13.9
85
0
3.4
6.8
10.5
90
0
3.4
7.0
95
0
3.5
100
0
*在0℃下，硫酸铵溶液由初浓度调到终浓度时，每100mL溶液所加固体硫酸铵的克数。
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