线栓法大鼠大脑中动脉阻断实验MCAO模型的经验.docx

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线栓法大鼠大脑中动脉阻断实验MCAO模型的经验

线栓法大鼠大脑中动脉阻断实验（MCAO模型）的经验

本人现在正在做线栓法大鼠大脑中动脉阻断实验（MCAO模型），这方面的资料我查了一些，这个实验我也作了一段时间，不敢说很专业了，不过现在基本上我能在15min左右完成手术，而且手术过程中不出一滴血，造模后缺血程度基本一致。

虽然前面有很多前辈发了很多MCAO的很专业的贴子，不过我觉得比较凌乱，现在我把我的心得体会和以前的贴子的精华部分奉献给大家，希望这会对将要做这个实验的朋友有一丝的帮助。

虽然做实验总会有郁闷的时候，不过风雨之后总会见到彩虹的，这可以也是我的心得体会。

衷心祝福大家能把实验做的成功、完美！

实验前准备

麻醉剂：

水合氯醛（应较好的控制大鼠体温）

保温：

60W白炙灯高度为37cm直接照射能使肛温保持在37℃

栓线的制备：

1.取熔点为56℃的固体石蜡一块，在瓷杯中加热熔化。

直径为0.24mm、长5cm的鱼线一端5mm长的一段，垂直在熔化的石蜡中迅速浸入并提起，立即凝固的一薄层石蜡可牢固地粘附在鱼线一端的表面，其直径为0.26mm。

就这样，普通的鱼线即可变成规相一致头端光滑圆钝的栓线。

2.在鱼线18mm的位置用涂改液标记一个白色点。

TTC的配制：

用0.2mol/L磷酸缓冲液（PBS）配成2%TTC溶液（pH7.5），避光保存

体重与栓线直径：

线栓直径0.24mm采用的SD大鼠，体重250-300g。

实验方法：

动物用10％水合氯醛（35mg/kg）腹腔注射麻醉。

仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。

用微动脉夹暂时夹闭ICA，然后近心端结扎CCA、ECA。

然后在距CCA分叉部4mm处剪一小口，将拴线插入到ICA，这时用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢拴线。

（不可过紧，否则进线困难，但松了又会出血。

）用眼科镊轻推拴线，从血管分叉处开始算距离，当插入深度在18mm时（一定要将血管放松至原来状态,且保证标记点在分叉处,由于标记的是白色的所以很容易看的），紧紧系牢CCA远心端的细线，此时的关键是动作轻柔，不要使ICA有任何的牵拉，否则栓线会脱出ACA，可能会造成缺血失败。

血管外的栓线不要留得过长，更不要缝在皮外，大鼠醒来后会自己拔出。

缝合伤口，单笼饲养观察。

如果需要再灌的话，就把拴线抽出即可，因为脑底有个动脉环，结扎一侧颈总动脉大脑不会缺血的。

注意事项：

1．分离时要层次清楚：

正中剪开SD大鼠颈部皮肤，分离皮下结缔组织时会发现该组织与颈部两侧鼓泡腺体（很多人误认为那是甲状腺）结合紧密，因此不必分离过于太细，直接在正中两侧鼓泡腺体之间分离，这样能不接触胸锁乳突肌而直接暴露颈前颈群且不会损伤腺体造成过多出血。

下一步是分开颈前肌群，这时候要注意用小钳子作撑开分离动作要在左右肌肉块之间而不是一块肌肉的肌纤维之间，虽然它们看起来很模糊，但这样能保证不会出现较多条索状细肌纤维条影响下一步颈内动脉的寻找与分离，并且能整块地向一侧牵开颈前肌群暴露颈动脉鞘。

见到颈动脉鞘了则要注意细致分离迷走神经，若损伤则可能影响其呼吸而死亡的。

2.分离血管时，要尽量将血管剥离的干净些，这样在用眼科剪剪口时就不会误剪外膜（误剪的话再剪就很容易把口剪大了或者剪断了，要注意口子越小越好插线），且要剪一个斜行的切口（眼科剪与血管约成45度），这样在血液刚流出时仍能看上翻的断口管壁，这样即容易插入栓线且血管受得了插线时一定的牵拉。

当然，切勿牵拉过猛，以免使血管发生痉挛，导致栓线不能顺利进入。

3.注意尽量不要损伤在颈内颈外分叉下的交感神经节。

4.如果你用的是中长效麻醉剂，插线成功后，固定丝线，然后让其俯卧位，而且稍稍抬高其颈部，才能确保模型成功。

5.栓线进入后颈内动脉后即可逐渐插入了，有时候很顺利一插到底，但有时候在中间就怎么也进不去了，这是因为在血管入颅穿过颅骨时有一个狭窄或者角度。

因此，碰上这种明显阻力时，一定不能盲目向前使力插，越插栓线前端变形越进不去且容易损伤血管。

这时候正确的作法是往外抽出较多栓线，也许会有一定的动脉血流出，不必慌，只要顺着血管走行调整一下进线角度轻柔的使劲，一般都能进去，反复试几次还不行最好换根栓线，很可能前端也经变形角度变了！

颈内动脉的走向为内上方，可以用眼科镊夹住鱼线插，但进去后要注意，别太用力，要不血管就要破了。

6.栓线不能在血管里反复进退，否则及容易造成蛛网膜下腔出血，而且很容易误解为模型成功，因为这时的神经功能改变也很明显，但并不是由于栓塞引起的。

7.进线时，使栓线有一定程度的弯曲，且只要保证栓线向屋顶方向弯曲，一般都能将线插如颅内，决不会进入翼腭A。

8.术后一定要注意保暖。

9.插入线拴要轻柔熟练，速度尽可能快，以避免时间长了血管内血栓形成。

10．手术后评分的主观因素很大，有用5分制和11分制的，我个人认为用5分制比较准些。

舍去标准：

⑴栓线插入深度不足18mm，且无明显神经功能缺损表现或症状很轻的大鼠

⑵蛛网膜下腔出血、MCA起始部或其附近的willis环动脉有凝血块的大鼠，因为这是出血性脑损伤或永久性脑缺血损伤，而非MCAO/Reperfusion损伤。

3）手术时出血较多，症状很重的动物

死亡原因分析：

首先要找出死亡原因，解剖死亡大鼠的脑，先看是否有蛛网膜下腔出血，如有出血，表明死因是插线太深，以后注意插线深度；如无出血，则还要再看是否有严重的半球水肿，如水肿严重，则表明死因是脑缺血时间太重，需要缩短缺血时间；如既无出血，又无明显的脑水肿，那就要注意动物状态或生活环境是否太差。

附带的其他说明：

1.线拴法存在一定的死亡率。

对于这情况我感觉比较头疼，也希望高手指点。

2.模型成功率和评价指标是相关联的矛盾，手术后可根据动物的表现加以评分，确定模型是否成功，模型成功与否会对结果的评价带来影响。

有可能你模型没成功，结果判断为是药物的作用效果。

所以对手术后模型是否成功应该进行筛选的。

另一方面，如果你做了预防给药，药效的作用也容易被认为是模型不成功，这也需要后边进行脑组织染色和组织血检查进行验证。

脑组织检查时可剔除模型不成功以及SAH的个例。

故实验在手术后要进行行为学评分，试验结束时应对脑组织进行组织学检查或染色。

TTC染色是采用的宏观标本染色，确定梗死面积可采用体积法或面积法，但最好用扫描仪将脑组织切片进行扫描，选择合适的软件统计梗死面积。

3.大鼠大脑中动脉永久性闭塞性脑缺血模型，梗死体积出现的最小时间点可能为2h，体积随时间进行性增大，至12h基本趋于稳定

4.整个试验是很费动物的，存在15-30％的淘汰率（如果你做的好），但注意严格控制自己淘汰的动物（纪录具体情况）。

5.除了刚才说的蛛网膜下腔出血外，还有一些老鼠肺出血明显，整个肺暗红，我也想不出原因，不知道是不是医学临床所说的脑肺综合症.

6．在颈内和颈外之间常常会有一个交通支，其位置也不太相同，一定要万分小心，我曾经因为不知有这个交通支而勿将其破坏，导致大鼠出血不止！

7.手术示意图如下：

线栓法大鼠脑缺血模型（MCAO）的制备技巧

如何提高脑缺血的成功率?

经常有朋友费了九牛二虎之力，做了几个大鼠MCAO模型，第二天一看，个个活蹦乱跳，毫无脑缺血症状，当场晕。

不成功的主要原因是栓线插入深度不够，即栓线的前端未进入大脑前动脉（ACA），拴线的粗细倒是次要的，0.20～0.26mm均可。

因此，保证栓线进入ACA并阻断对侧来的血流，而又不刺破血管是重中之重。

如图1尼龙线光滑的末端，不仅大大减轻了插线对血管内皮的损伤，降低了刺穿血管的可能性，而且可以更严密的阻断从大脑前动脉供应的来自对侧的血流，更为可贵的是，因为球端直径为0.32mm，插线时可以非常方便的插到位（如图2）。

用240～280g的大鼠，栓塞1h即可造成稳定的脑梗死。

图2大鼠脑血管解剖示意图（红线表示栓线的插入位置）

（一）制备技巧

秘诀1：

许多文献报道插入深度为18.5±0.5mm（270g左右大鼠），如果按这一标准去做，而不考虑大鼠的个体差异，后果是缺血的程度参差不齐，很多大鼠会出现症状较轻，甚至无症状。

建议当插线近18mm（做上标记）时，注意手的感觉，轻缓推进，直至感觉到阻力为止（当遇到阻力后，再插线会见到线弯曲）。

可能有人会说，把血管插破了也未感觉到阻力或线遇阻后的弯曲。

一个原因是线太硬，另一主要原因是当栓线从血管切口插入后为防止血液从此处流出，需要结扎一条细线，这条线结扎的松紧程度很关键，应在不流血的情况下尽可能的松，这样你会发现进线时很轻松，一旦遇到阻力，就会感觉到。

后者至关重要，请体会。

秘诀2：

栓线一旦进入ACA，就要把上面提到的那根细线适度扎紧（“适度”很重要，会影响到再灌流时大鼠的生死存亡），此时的关键是动作轻柔，不要使ICA有任何的牵拉，否则栓线会脱出ACA，可能会造成缺血失败。

血管外的栓线不要留得过长，更不要缝在皮外，大鼠醒来后会自己拔出。

（二）如何避免栓线插入翼腭A

大鼠仰卧时，ICA从CCA分出后下行（向背侧）约5mm又分为两支A，即走向乳突泡（Mastoidbulla）的翼腭A和进入颅内的ICA的延伸部分。

因为翼腭A的走向几乎和分支前的ICA走向相同，而ICA的延伸部分则是改向头侧走行，所以插线时会很自然的进入翼腭A，需反复拔插几次，碰巧后才能进入颅内，非常痛苦。

最初我干脆将翼腭A也分离，然后夹闭或结扎翼腭A的起始部，结果是手术很难操作，效果也不理想。

后来又改用另一方法，即在栓线将要插入翼腭A前，用镊子将ICA轻轻往头侧推一下，使ICA和其延长的分支成一直线，同时顺势插线，可很容易的进入颅内。

随着经验值的增加，发现完全可以通过改进栓线形状达到目的，即使栓线有一定程度的弯曲，插线时只要保证栓线向屋顶方向弯曲，闭着眼睛也能将线插如颅内，决不会进入翼腭A。

图30.24mm栓线阻断大鼠MCA1h再灌注24h的TTC染色

尼龙线的使用说明

1.实验开始前，将尼龙栓线用75%酒精擦洗干净，在距球端18.5mm处做标记（用防水的蓝色或黑色记号笔），置0.9%的无菌生理盐水中备用。

2.将大鼠用10%水合氯醛生理盐水溶液麻醉（350mg/kg，ip），仰卧于手术台上。

颈正中切开皮肤，依次分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），烙断ECA的分支动脉，结扎ECA远端并烙断。

3.用动脉夹夹闭CCA和ICA。

4.在ECA剪一小口，用注射器注入60u肝素钠生理盐水溶液0.1ml（注射时，松开ICA的动脉夹。

注射后，再次夹闭）。

5.将尼龙栓线插入ECA，并用手术线轻轻用力结扎。

6.松开ICA的动脉夹,将尼龙栓线顺势插入ICA，插入18.5±0.5mm至大脑前动脉（ACA）起始部，阻断大脑中动脉（MCA）的血液供应。

大鼠大脑中动脉阻塞再灌注模型改良的实验研究

作者：

牛建国,文玉军,张莲香,王效军,何仲义作者单位：

宁夏医学院基础学院人体解剖学教研室，银川750004

【摘要】目的通过对大鼠大脑中动脉阻塞（middlecerebralarteryocclusion，MCAO）再灌注模型神经功能缺失评分的计算和脑梗死体积的测量，评价改良的大鼠MCAO再灌注模型，为实验研究提供可重复性好、稳定可靠的动物模型。

方法20只SD大鼠随机分为A、B两组，A组用头端烧制成圆球的传统“圆头线栓”，B组采用头端用万能胶包裹成梭形膨大的改良“梭头线栓”制作大鼠MCAO模型，阻断大脑中动脉血供3h后将“线栓”拔出，造成再灌注损伤。

采用“盲法”分别于再灌注10min和再灌注24h对大鼠进行神经功能缺失评分；再灌注24h后处死大鼠，脑切片TTC染色，数码相机照相，采用图像分析系统测量脑梗死体积比；根据统计结果评价改良的MCAO再灌