抗菌肽生物合成的研究进展.docx

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抗菌肽生物合成的研究进展

目录

摘要1

关键词1

第一章绪论1

1抗菌肽起源及分类1

1.1抗菌肽的发现1

1.2抗菌肽的来源2

1.2.1昆虫抗菌肽2

1.2.2蛙类抗菌肽2

1.2.3鱼类抗菌肽2

1.2.4哺乳动物抗菌肽2

1.3抗菌肽的分类3

2.抗菌肽的理化性质和作用机制3

2.1抗菌肽的理化性质3

2.2抗菌肽的作用机制3

第二章抗菌肽的生物合成及研究进展4

1抗菌肽的设计及合成4

1.1抗菌肽的设计4

1.1.1序列修饰法4

1.1.2最低纲领法5

1.1.3合成组合文库5

1.1.4模板辅助法5

1.1.5生物信息分析和软件辅助法5

1.2抗菌肽合成的基本方法5

1.2.1液相合成6

1.2.2固相合成6

1.2.3片断法合成7

2抗菌肽现阶段的研究进展及应用8

2.1抗菌肽在农业中的研究与应用8

2.2抗菌肽在医药领域的应用8

2.3抗菌肽在食品方面的应用9

第三章抗菌肽的应用前景及存在的问题9

1抗菌肽的应用前景9

2抗菌肽的应用中存在的问题10

参考文献：

11

Abstract13

Keywords13

致谢14

抗菌肽的生物合成研究进展

白俊

（德州学院生命科学学院，山东德州253023）

摘要：

抗菌肽最早是指昆虫体内经过诱导而产生的一种有抗菌活性的多肽物质，分子量通常在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基构成。

这一类型活性多肽大多具有强碱性、热稳定性和广谱抗菌等特点，更因其具有包括抗细菌、真菌、病毒、原虫、癌细胞等多种生物在内的活性，且很难产生抗药性，所以应用前景十分广阔。

本文概述了抗菌肽的分类、结构特征、生物活性、作用机制以及抗菌肽生物合成的方法、应用，指出抗菌肽研究和应用中的存在问题。

关键词：

抗菌肽；结构特征；作用机理；生物合成

第一章绪论

抗菌肽（antibacterialpeptide，ABP）是一类由生物机体免疫防御系统产生，用以对抗外源性病原体的多肽类活性物质，广泛地存在于包括昆虫、动植物以及人体内，同时具有抵御外界微生物侵害、消除体内突变细胞能力的一种小分子多肽。

目前已经有多达五百多种抗菌肽被分离和鉴定，部分已可以人工合成。

抗菌肽可大致分成四类:

杀菌肽类、富含脯氨酸残基的蛙皮素、富含甘氨酸残基的蜂毒素、富含肌氨酸残基的防御素。

这些抗菌肽除了具有广谱抗菌能力外，还有高效专一的抗真菌和抗病毒、抗肿瘤能力。

因此，这种抗菌肽类物质在现代医药、农业、以及生物技术上有广阔的应用前景，在此基础上人工合成抗菌肽则更显得意义重大。

1抗菌肽起源及分类

1.1抗菌肽的发现

抗菌肽（antibacterialpeptide）是在1974年由瑞典的科学家Boman等，通过向眉纹天蚕蛾（Samiacyhthia）蛹注射大肠埃希菌后，在血淋巴细胞中发现的一类具有抗菌活性的碱性多肽类物质，随后在古比天蚕（Hyalophracecropia）蛹中同样发现了类似的抗菌活性物质，这种具有抗菌活性的物质于1981年被正式命名为抗菌肽（cecropin）。

1.2抗菌肽的来源

1.2.1昆虫抗菌肽

昆虫抗菌肽是最先从美洲天蚕的蛹中分离到的抗菌多肽，命名为天蚕素或者杀菌肽。

此后，人们相继从家蚕、柞蚕、果蝇、麻蝇中也分离到了此类多肽抗生素。

杀菌肽类对革兰氏阳性菌以及阴性菌都具有很强的杀伤力，但对真菌和真核细胞并没有毒性。

目前，杀菌肽类已能被人工合成并已商品化。

1.2.2蛙类抗菌肽

蛙皮肤上有许多腺体，能产生很多种类的生物活性肽。

蛙皮素首先在非洲爪蟾中发现，含有21-27个氨基酸的一种碱性无半肌氨酸的抗菌肽。

微摩尔浓度的Magainins就能杀死革兰氏阳性细菌、阴性细菌、真菌、原生动物，甚至真核生物的肿瘤细胞，但却不伤害体细胞或红细胞。

Magainin家族肽由于其氨基酸的数目少，具有抗菌活性，当人类感染细菌、真菌或原虫之后，可能具有治疗疾病的潜力。

目前应用基因工程的方法合成Magainin已经进入临床三期试验阶段。

1.2.3鱼类抗菌肽

鱼类抗菌肽是鱼机体天然免疫的重要部分，是一种小分子蛋白质，它的结构与组成复杂多样。

鱼类抗菌肽的合成多数以前肽原形式，通过酶解方式切除信号肽以及羧基端酸性片段后，形成具有活性的成熟肽。

成熟肽有很强的抑菌活性，其最小的抑制浓度大多在毫摩尔水平。

迄今，几十种鱼类抗菌肽已被分离出来，并且多个抗菌肽基因已经能被克隆。

1.2.4哺乳动物抗菌肽

在哺乳动物中，抗菌肽由吞噬细胞和黏膜上皮细胞表达。

Lee（1989）最先从猪小肠分离出杀菌肽P1，Agerberth（1991）从猪小肠分离出抗菌肽PR-39。

Andersson（1995）又从猪小肠纯化得到抗菌肽NIA-lysin。

Heller（1998）从猪白细胞中分离得到抗菌肽Protegrins（PGs）。

Schonwetter（1995）从牛中性粒细胞分离得到抗菌肽Bactencin。

Shamova（1999）从绵羊、山羊白细胞分离得到的抗菌肽OaBac5和CHBac5与牛Bac5同源，富含有脯氨酸，具有广谱抗菌的特点。

1.3抗菌肽的分类

根据迄今对抗菌肽的研究可以发现，对抗菌肽的分类方式除来源不同外，还有根据其结构与特点来进行分类，常见还有以下几种分类方式。

一种是将抗菌肽分成五类:

杀菌肽（cecropins）、爪蟾抗菌肽（magainins），防御素（defensins），宣肽素（tachyplesins）以及内源型抗菌肽（cathelicidin）。

另一种则是根据抗菌肽的二级结构和构象组成特征，进而将抗菌肽分成四型:

α-螺旋抗菌肽，具有二硫键的β折叠抗菌肽，富含脯氨酸（Pro）和甘氨酸（Gly）的抗菌肽，和具有板状结构的抗菌肽。

此外还有根据其所带电荷进行相应的分类，为:

普通阴离子型，普通阳离子型，特殊氨基酸的阳离子型，二硫桥型，片段型。

2.抗菌肽的理化性质和作用机制

2.1抗菌肽的理化性质

虽然抗菌肽的结构各异，但几乎所有的抗菌肽在其本质上都具有一些共性，其理化性质现在已基本清楚，它们通常是由1250个氨基酸组成，相对分子质量通常在4KD左右，它们是生物先天免疫防卫系统的重要组成部分[1]。

大多数抗菌肽的水溶性很好、等电点大于7，有较强的阳离子特征，并具有两亲α-螺旋或两亲β-折叠结构。

据郭玉梅等报道，家蚕抗菌肽在高温高压下处理30min仍能保持其原有活性，足以说明抗菌肽具有热稳定性。

抗菌肽在较大的离子强度及较低或较高的pH值下仍能保持较强的活性[2]。

但还有文献报道，已经发现了具有阴离子特性的抗菌肽类型，其作用机制和阳离子抗菌肽也不尽相同[3]。

除此之外，一些抗菌肽还有抵抗胰蛋白酶及胃蛋白酶水解的能力。

2.2抗菌肽的作用机制

虽然人类至今还没有完全了解抗菌肽的详细作用机制，但根据现有的多项相关研究可以表明，大部分的抗菌肽可以直接作用于微生物细胞膜。

因此科学界现在主要提出了三种理论模型，其中包括:

孔洞学、可变毯模型和离子通道学说，而相关抗菌肽的通路和热力学的研究目前还在进行。

其中基于抗菌肽对细胞膜的作用是被广泛接受的观点，这种观点认为大多数抗菌肽最根本的作用机制是，由于带正电荷的多肽，通过静电作用和带负电的磷脂膜结合，形成螺旋或者折叠结构，从而在细胞膜上形成了离子通道或裂解细胞膜，从而破坏了细胞或细菌质膜的结构，导致大量胞内水溶性物质渗出，进而达到杀死目标微生物的作用。

另一种观点是基于细胞内机制[4]，如α-螺旋结构的抗菌肽分子是亲水和疏水两亲性的，故在与细胞膜结合后，可以通过膜内分子间位移，最后使得抗菌肽分子聚集而形成离子性通道，改变细胞膜势，进而杀灭微生物。

近期的研究对抗菌肽作用机制提出了新的观点，最新研究发现，有部分抗菌肽能先通过静电作用和细胞膜相互吸引与结合，其形成的离子通道为瞬时的，能使得抗菌肽进入胞质和细胞内容物作用，例如抑制核普酸[5]、抑制蛋白质[6]、影响线粒体[7]等。

另外还有研究指出有部分抗菌肽杀灭细菌后，其细胞膜结构却无损坏，以上研究都表明抗菌肽可能对细菌的作用存在着胞内作用靶点。

以上几种观点都能较好地阐释抗菌肽对正常的真核细胞基本无作用或为低作用，因为真核细胞的膜表面主要为中性或兼性磷脂，故抗菌肽对其作用较弱。

由于抗菌肽自身具有一定安全性，并有有效抑菌的功能，其分子结构特征又是发挥上述机制作用的重要基础，故人工改造与合成抗菌肽便有了重要的意义。

第二章抗菌肽的生物合成及研究进展

1抗菌肽的设计及合成

1.1抗菌肽的设计

虽然抗菌肽和传统抗生素相比表现出了许多优点，但是很多天然抗菌肽药物的代谢动力学与药物毒性还不是很清楚，其生产和制备成本比较高，且部分抗菌肽抗菌谱较窄、抗菌活性较低、稳定性差，有些抗菌肽活性和溶血活性都较强，故设计或改造抗菌肽来获得更加安全、有效、稳定的抗菌肽则具有现实意义。

目前为止抗菌肽的设计主要是利用结构辅助设计的方法来对母肽分子进行适当的改变来优化抗菌肽的净电荷、疏水氨基酸残基比例、两亲性、分子柔性或特定的二级结构。

1.1.1序列修饰法

该方法包含了所有对天然抗菌肽修饰，包括删除、添加或者将一个或多个氨基酸残基更替、截断肽的N-端或C-端或者将组天然肽的不同肽段嵌合。

此方法已经被广泛应用于Cecropin，Magainin和Melitti的研究[8，9]。

1.1.2最低纲领法

该方法包含了全部基于两亲α-螺旋抗菌肽结构的从头设计。

一般限制一或多个基本氨基酸例如赖氨酸或精氨酸，与此同时限制一或两个疏水性残基如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。

该方法可得到相当强效的抗菌剂，但他们忽略了进化过程对肽序列氨基酸的选择，这样有可能会导致失去抗菌肽的选择性。

1.1.3合成组合文库

合成组合文库能快速获得活性化合物的优化分类。

用这种方法开发的α-螺旋抗菌肽存在一个问题，由于抗菌肽分子较大（超过10个氨基酸残基），这使得位置扫描或者迭代的方法不切实际。

1.1.4模板辅助法

这种方法通过比对天然抗菌肽的序列并抽象统计其显著特性（如电荷、疏水性等等）的从头设计方法。

该方法的优点是减少了肽合成的数量但是得到有用的结果，它与序列修饰方法相比较保存了肽序列的基本信息。

1.1.5生物信息分析和软件辅助法

生物信息学包括了数学、统计学、计算机科学、信息技术和分子生物学等学科，它研究的领域主要包括:

药物设计、基因进化、基因组序列分析、基因区域、功能预测和蛋白质的结构预测等。

该学科在海量数据的高效分析上发挥重要作用。

生物数据库主要涵盖基因组学、蛋白质组学以及功能信息学的庞大信息，具有强大的数据组织及处理功能。

特别是针对抗菌肽而构建的抗菌肽数据库已经成为抗菌肽开发设计及研究不可缺少的辅助工具，其主要分为四大类:

（1）天然抗菌肽数据库:

AMSDb，APD，DAMPD，YADAMP和AMPer；

（2）天然的特定抗菌肽数据库:

Peptaibol，PenBase，BACTIBASE，Defensins，DAPD和PhytAMP；（3）非天然来源的抗菌肽数据库:

SAPD和RAPD；（4）抗菌肽预测数据库:

BAGEL，AntiBP和CAMP。

生物信息分析及软件辅助的抗菌肽设计方法主要对抗菌肽的结构及活性进行分析、预测，在较低的花费和较短的时间成本下获得相对可靠的信息。

1.2抗菌肽合成的基本方法

1.2.1液相合成

抗菌肽最早的合成是使用液相合成的办法，即把需要合成的氨基酸或者短肽配制成液体溶液，其中之一的氨基端和另外的羧基端及不发生反应的侧链基团被有效的化学基团保护，而需要反应的氨基端和竣基端则分别活化，在液体中发生化学反应，二者偶连在一起。

反应完毕后，需要用各种方法把没有参加反应的原料试剂和活化试剂分离出去，以便纯化