激光扫描共聚焦显微镜技术讲解.docx

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激光扫描共聚焦显微镜技术讲解

激光扫描共聚焦显微镜技术

LaserScanningConfocalMicroscope

——基础篇

李治国

细胞的内在生活

显微镜的发展史

没有显微镜就不可能有细胞学诞生。

1590年，荷兰眼镜制造商J和Z.Janssen父子制作了第一台复式显微镜。

1665年，英国人RobertHook首次描述了植物细胞（木栓，命名为cella。

1680年，荷兰人A.vanLeeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。

MadebyA.vanLeeuwenhoek（1632-1723.

Magnificationrangesat50-275x.

显微镜的最重要参数

——分辨力

显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关。

分辨率是指区分开两个质点间的最小距离

各种显微镜的分辨能力

光学显微镜（lightmicroscopy）0.2μm

电子显微镜（Electromicroscopy0.2nm

扫描遂道显微镜（scanningtunnelingmicroscope0.2nm以下1932年，德国人M.Knoll和E.A.F.Ruska发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm的商品电镜。

1981年，瑞士人G.Binnig和H.RoherI在IBM苏黎世实验中心（ZurichResearchCenter）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺贝尔物理学奖。

常用的光学显微镜（lightmicroscopy

普通光学显微镜

暗视野显微镜

相差显微镜

偏光显微镜

微分干涉显微镜

荧光显微镜

激光共焦扫描显微镜

普通光学显微镜原理

普通光学显微镜原理图

1.构成：

①照明系统

②光学放大系统

③机械装置

2.原理：

经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。

暗视野显微镜

根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜

观察到明场看不到的极其微小的物体

最高分辨率可达0.004微米

1原理

丁达尔现象：

在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这就是微粒的散射光。

暗视野显微镜就是利用微粒的散射光原理设计的。

2结构特点

使用中央遮光板或暗视野聚光器（常用的是抛物面聚光器），使光源的中央光束被阻挡。

不能由下而上地通过标本进入物镜。

从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。

暗场显微镜原理

3成像特点

在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像，并非物体本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。

但被检物体为非均质时，并大于1／2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。

一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜（最大的分辨力

为0.2um所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。

4应用：

微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。

5暗场显微镜的要求

要求载玻片和盖玻片必须无疵痕和灰尘

物镜前透镜必须清洁无尘

载玻片和盖玻片厚度必须绝对符合要求

6暗场观察方式调节

（1换上暗场聚光镜（干燥系或油浸系）并在聚光镜透镜上表面滴上镜头油。

向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片底面相接触后。

（2将视场光阑适当缩小，用10X物镜找到被检物体，同时在视场中看到视场光圈的轮廓象。

上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈像清晰可见。

（3视场光圈如不在视野中央，可利用聚光镜外侧两个调节螺丝进行调整，再将其开大到相应位置。

人的眼睛能够识别明与暗之差（光的强度）和颜色不同（光的波长不同），但难以识别差别小的无色的透明物体。

光对无色透明物体（相位物体）并不引起明、暗和颜色的变化，而只产生所谓的相位差。

可是这种相位差不能用肉眼识别，也就看不见这种相位物体了。

相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。

光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。

相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅差（明暗差，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。

因此可用以观察活细胞或未染色标本。

环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。

在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑。

用于观察组织培养中活细胞形态结构。

活细胞无色透明，一般光镜下不易分辨细胞轮廓及其结构，组织培养研究常用的是倒置相差显微镜。

偏光显微镜

依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以此判别物质结构的一种显微镜分辨率可达0.04微米将普通光改变为偏振光进行镜检,以鉴别某一物质具有单折射性（各向同性或双折射性（各向异性偏振光与自然光

1.横波的偏振性

光矢量的振动方向总与光的传播方向垂直，在垂直于光传播方向的平面内,可有不同的振动方向。

2.线偏振光--光矢量只在某一固定的方向上振动。

二、起偏和检偏

起偏：

使自然光（或非线偏振光）变成线偏振光的过程。

检偏：

检查入射光的偏振性的过程。

双折射现象：

一束光射入各向异性晶体后有两束折射光的现象。

尼科耳棱镜。

在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各向异性，淀粉粒、染色体和纺锤体等具有双折射性，因此被用于组织细胞的化学研究。

寻常光线（o光:

遵守折射定律。

对于晶体一切方向都具有相同的折射率，且在入射面内传播。

非常光线（e光:

不遵守折射定律。

它的折射率随方向而变化，并且不一定在入射面内传播。

o光和e光都是线偏振光,且振动方向相互垂直

二向色性：

某些晶体（电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等）对光振动有强烈的选择性吸收能力，这种性质称为二向色性。

如电气石晶体对自然光的某一振动方向上的光振动几乎完全吸收，而垂直于该方向的光振动只稍微减弱后通过。

旋光现象：

线偏振光通过某些透明介质后，它的光振动方向将绕着光的传播方向旋转某一角度的现象，称为旋光现象。

这种介质称为旋光物质。

如石英、糖、酒石酸钾钠等。

微分干涉显微镜

无色透明活体标本的细微结构

图象呈浮雕状的立体感

观察效果更加逼真

1原理

通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，

光束载极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。

2特点

可以使被检物体产生三维立体感觉

观察效果更直观

无须特殊物镜，与荧光观察配合更好

可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。

荧光显微镜Fluorescencemicroscope

特点：

光源为短波光，信噪比高

荧光显微镜

一、原理

荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光（如紫外光3650入或紫蓝光4200入作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。

这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。

荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件（如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等的基础上组成的。

荧光显微镜Fluorescencemicroscope

特点：

光源为短波光，信噪比高

荧光光源一般采用超高压汞灯（50一200W，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。

每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。

荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断滤光片。

它的作用有二：

一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛。

二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。

两种滤光片必须选择配合使用。

荧光显微镜用途

1观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构2标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。

组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细胞和视网膜

色素上皮细胞内的维生素A呈绿色荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、5－羟色胺、组胺等）在甲醛作用下呈不同颜色的荧光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。

3细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。

4荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原的存在与分布。

用于观察能激发出荧光的结构。

用途：

免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。

缺点分辨力不高

激光共焦扫描显微镜

（LaserScanningConfocalMicroscope，LSCM）

LSCM的基本结构、工作原理

荧光探针的选择原则

LSCM在生物医学领域中的应用

激光共聚焦扫描显微镜简介

80年代研发的新型显微镜

以荧光显微镜成象原理为基础

采用激光扫描装置，利用计算机生成图象

得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，在亚细胞水平上观察细胞，还能显示诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。

发展史

1、20世纪50年代中期提出。

MarvinMinsky在哈佛大学博士后工作期间，提出了共聚焦显微镜的基本概念，并于1957年申请了技术专利。

Minsky的发明并没有马上引起人们的注意，主要原因是没有足够强度的光源，并且当时计算机的能力还不足以处理大量的数据。

2、90年代发展成熟。

随着光学和电子技术的发展产生了更稳定和更强的激光、更高效的扫描镜片组、高效能的光纤、更精细的镀膜技术和更低噪音的检测器。

更多适合激光激发的荧光染料不断被合成。

相应的计算机处理器速度快速发展，图像显示技术增强和大容量的存储设备的产生，推动了激光扫描共聚焦显微镜迅速普及。

2006年购入OLYMPUSFV1000，耗资18.7万美元。

激光扫描共聚焦显微镜结构和工作原理

目标要求

1.掌握激光扫描共聚焦显微镜技术的工作原理。

2.熟悉激光扫描共聚焦显微镜的结构。

3.了解激光产生的原理。

4.了解激光扫描共聚焦显微镜的功能。

一、基本组成

（一）激光器:

多线氩离子（458nm,488nm,514nm、氦氖绿（543nm、氦氖红（633nm

（二）扫描器（内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光单色器及检测器、荧光显微镜（装有微量步进马达系统，实现点光源在样品上逐点逐层扫描成像

（三）光学装置：

根据样品中荧光信号的强弱、大小及分布，调节激光能量、检测孔光栏、光电倍增管（PMT）的检测范围、物镜和电子放大倍数（zoom），以利于采集各种荧光信号。

（四）计算机图像存储与处理及控制系统：

实现了图像的优化、三维重建，实现了全自动程序化控制采集（检测）样品荧光图像的时间和空间，并和同时采集样品中多重荧光信号的分解及合成图像，对其进行定量测定。

二、激光器激光产生的原理

（1）受激吸收

激光器的结构

激光工作介质

在这种介质中可以实现粒子数反转，以制造获得激光的必要条件。

激励源

通过一定的方式使处于高能级的粒子数增加。

包括电激励，光激励，热激励、化学激励等方法。

谐振腔

光在谐振腔中来回振荡，造成连锁反应，雪崩似的获得放大，产生强烈的激光，从部分反射镜子一端输出。

三、扫描器

四维扫描模式

激光扫描共焦显微镜的发展趋势

多光子激光扫描显微镜—MultiphotonLaserScanningMicroscopy

在生物及医学成像,单分子探测,三维信息存储,微加工等领域得到广泛应用,展示了广阔的发展前景.

多光子激光扫描显微镜简介

1.多光子激光器波长从700-1000nm连续可调

双光子波长：

350-500nm连续

三光子波长：

230-330nm连续

应用：

可直接清晰活体观察某些非标记神经递质的分泌（5-HT或NADPH的分布

多光子激光扫描显微镜优点与局限:

优点:

1对生物样品的光损伤小

2有效观测时间长

3穿透深度深

4荧光收集率高

5对探测光路的要求低

6适合多标记复合测量

局限:

1只能对荧光成像

2样品可能受到热损伤.（若样品含吸收激发光的色团,如黑色素3超快激光器较为昂贵

四、激光共聚焦扫描显微镜技术特点激光光源逐点、逐行、逐面快速扫描被激发荧光成像共聚焦：

扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点

五、激光共聚焦扫描显微镜技术优点

用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。

采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,

将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束（点光源逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。

而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。

这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。

用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图

在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。

而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。

由于综合利用了以上技术。

可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。

五、激光共聚焦扫描显微镜应用优势

半定量分析方便。

激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。

分辨率高。

由于激光束的波长较短，光束很细，排除焦平面以外光的干扰，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。

可重构样品的三维结构。

系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内，调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机重新组合，就能显示细胞样品的立体结构，给出细胞内各部分之间的定量关系及各种结构线度。

可连续摄像

六、LSCM的功能

1.获取透射光、反射光及荧光图像，能进行定性及定位分析及图像处理

2.无损伤、连续光学切片，显微“CT”

及三维重组

3.连续摄像

4.光谱扫描

激光扫描共聚焦显微镜

荧光探针的选择

学习目标

1.了解荧光产生的原理。

2.掌握荧光淬灭的概念及影响荧光淬灭的因素。

3.熟悉常用的荧光探针。

4.了解荧光样品的制备过程。

（一）荧光

一些物质原子受光照射时，能吸收入射光子的能量，使其电子从低能级向较高能级跃迁，处于这种激发态的分子不稳定，电子可通过跃迁的形式发射可见光子，放出多余的能量而返回基态，这种放出先前所吸收能量的可见光，即荧光。

荧光在停止激发的时候发光在10-7-10-8s内停止。

可见：

荧光是发射光。

即：

物质吸收短波光，发射出的长波光。

荧光的种类：

自发荧光（固有荧光）

二次荧光

3.荧光探针的用途：

1.蛋白质、单糖和多糖探针

2.细胞器探针

3.核酸探针

4.细胞活性探针

5.膜和受体探针

6.细胞膜电位和细胞内pH探针

7.金属离子探针

8.分子的特殊基团结合探针和其它

二、荧光样品的制备过程

（一）荧光标记前样品的准备

组织标本：

活的组织切片、冰冻切片和固定切片

细胞标本：

爬片、穿刺液涂片、液体沉淀涂片

在保证形态完整、达到试验目的的情况下，切片厚度越薄越好，一般为4-35μm

（二）用荧光探针标记样品

1.荧光探针的储存和配制

一般按产品说明书要求，避免反复冻融。

工作液现用现配。

2.正确溶解荧光探针

荧光探针的充分溶解是很重要的。

常用溶剂甲醇、乙醇、DMSO、水（生理盐水）缓冲液等。

储存液中荧光探针的浓度一般为10-1000μm。

注意：

a.甲醇、乙醇低沸点、易挥发，使用时防止其挥发造成探针浓度浓缩和干燥。

b.DMSO易凝固，要在25℃以上待其充分融化以后再用于溶解荧光探针。

c.对于难溶解的荧光探针，可考虑用超声溶解。

3.确定荧光探针标记待测样品的条件

影响胞内荧光探针浓度及分布的因素可分为两类：

a.由细胞本身决定的因素，如细胞种类、活性、膜表面积结构和大小、细胞内成分和结构等。

b.染色条件，如初始的细胞外染料浓度及细胞浓度、荧光探针与细胞孵育时的时间、PH、温度、接触面积、溶剂的极性、共存物质的种类等。

4.荧光染色方法：

（1生物样品与荧光探针（或其衍生物）直接结合，使样品具有荧光。

许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进入细胞。

可以用乙酰羟甲基酯（AM作为载体，将探针运送入细胞。

荧光探针与AM结合后变成不带电荷的亲脂性化合物，易于通过质膜进入细胞。

之后细胞内的AM被非特异性酯酶水解释放出荧光探针，由于探针的疏水性使其不易透出质膜。

荧光探针与细胞内的靶结构或靶分子结合，从而能有效的发挥作用。

例如：

Fluo-3就需要AM的辅助

（2显微注射法：

该法复杂精细，而且得到荧光的细胞少。

例如：

膜片钳导入法、微量电泳注射法、压力注射法

（3膜通透法增强探针跨膜能力例如：

透膜剂、低渗培养液或低pH培养液短期刺激。

（4首先用荧光探针将某些特定的分子标记，这些特定分子再与样品作用，通过检测细胞内荧光强度和位点，达到测定细胞内靶分子的含量及其定位的目的。

例如：

免疫荧光法、荧光标记的药物及蛋白的跨膜研究，尤其是间接免疫荧光法更为常用。

二、荧光样品的制备注意事项

依据试验目的选择合适的荧光探针及染色策略

例如：

Hoechst33258具有透膜性能，即能够跨过活细胞膜进入细胞标记DNA，也可以标记死细胞；而PI则不具备透膜性能，只能标记死细胞的核酸。

选择合适的探针浓度，防止非特异性标记。

合理设置对照，识别结果中的假阳性或假阴性。

保持样品应有的结构形态完整性。

荧光强度适宜、具有可重复性。

注意荧光稳定性

光敏效应弱：

主要表现为在光的作用下，荧光探针发生荧光淬灭或增强。

照射光强度越大、波长越短，则光敏现象越严重。

例如：

强光照射下荧光探针FITC易淬灭，而DCFH则会发生荧光增强。

环境因素：

探针所在介质的温度、组成成分（pH、淬灭剂的浓度等）样品中多重荧光之间的相互影响

光漂白性：

激发光的强度超过一定限度时，光吸收趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子。

图像背景低、非特异性染色少

尽早上机采集图像。

防止荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞干燥等导致的荧光变化。

重点内容回顾

荧光探针的用途：

1.蛋白质、单糖和多糖探针

2.细胞器探针

3.核酸探针

4.细胞活性探针

5.膜和受体探针

6.细胞膜电位和细胞内pH探针

7.金属离子探针

8.分子的特殊基团结合探针和其它

荧光样品的制备注意事项

依据试验目的选择合适的荧光探针及染色策略

例如：

Hoechst33258具有透膜性能，即能够跨过活细胞膜进入细胞标记DNA，也可以标记死细胞；而PI则不具备透膜性能，只能标记死细胞的核酸。

选择合适的探针浓度，防止非特异性标记。

合理设置对照，识别结果中的假阳性或假阴性。

保持样品应有的结构形态完整性。

荧光强度适宜、具有可重复性。

注意荧光稳定性

光敏效应弱：

主要表现为在光的作用下，荧光探针发生荧光淬灭或增强。

照射光强度越大、波长越短，则光敏现象越严重。

例如：

强光照射下荧光探针FITC易淬灭，而DCFH则会发生荧光增强。

环境因素：

探针所在介质的温度、组成成分（pH、淬灭剂的浓度等）样品中多重荧光之间的相互影响

光漂白性：

激发光的强度超过一定限度时，光吸收趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子。

图像背景低、非特异性染色少

尽早上机采集图像。

防止荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞干燥等导致的荧光变化。

荧光探针的用途：

1.蛋白质、单糖和多糖探针

2.细胞器探针

3.核酸探针

4.细胞活性探针

5.膜和受体探针

6.细胞膜电位和细胞内pH探针

7.金属离子探针

8.分子的特殊基团结合探针和其它www.P

荧光样品的制备注意事项

依据试验目的选择合适的荧光探针及染色策略

例如：

Hoechst33258具有透膜性能，即能够跨过活细胞膜进入细胞标记DNA，也可以标记死细胞；而PI则不具备透膜性能，只能标记死细胞的核酸。

选择合适的探针浓度，防止非特异性标记。

合理设置对照，识别结果中的假阳性或假阴性。

保持样品应有的结构形态完整性。

荧光强度适宜、具有可重复性。

注意荧光稳定性

光敏效应弱：

主要表现为在光的作用下，荧光探针发生荧光淬灭或增强。

照射光强度越大、波长越短，则光敏现象越严重。

例如：

强光照射下荧光探针FITC易淬灭，而DCFH则会发生荧光增强。

环境因素：

探针所在介质的温度、组成成分（pH、淬灭剂的浓度等）样品中多重荧光之间的相互影响

光漂白性：

激发光的强度超过一定限度时，光吸收趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子。

图像背景低、非特异性染色少

尽早上机采集图像。

防止荧光探针被排出细胞、荧光淬灭及细胞干燥等导致的荧光变化。

激光扫描共聚焦显微镜的应用

（一）细胞或组织内核酸的定位、定性

荧光探针分子与核酸的结合基本上有三种方式:

嵌入式结合方式、结构亲和方式、以共价键方式结合

1.常用核酸染料包括花青类和经典核酸染料两大类。

1花青染料包括:

核酸超敏定量和凝胶染色的染料，细胞非通透性的TOTO、TO-PRO、SYTOX染料家族，细胞通透性的SYTO染料家族，能用来形成生物交联物的化学反应性SYBR染料。

2经典核酸染料包括：

插层染料,如溴化乙锭和碘化丙啶（propidiumiodidePI；小沟结合剂,如DAPI和Hoechst染料；不同性质的核酸染料，包括吖啶橙（AO、7-AAD、LDS751和羟基芪脒（hydroxystilbamidine,各具有特殊性质。

图示活的牛肺动脉内皮细胞与细胞通透性的淡兰色荧光二氢乙锭和绿色荧光线粒体染料

图示DAPI与DNA结合的X-线晶体结构。

X-线晶体学显示DAPI与DNA在小沟结合。

DAPI是出色的核复染剂，可显示出清楚的染色体显带图案

（二）蛋白质的定位、定性

⏹免疫荧光

直接免疫荧光

间接免疫荧光

⏹绿色荧光蛋白

免疫学中抗原抗体知识回顾

常见的以免疫学为