植物一氧化氮NO酶联免疫分析ELISA.docx

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植物一氧化氮NO酶联免疫分析ELISA

植物一氧化氮NO酶联免疫分析ELISA

　　　　　　　　植物一氧化氮（NO）酶联免疫分析　　试剂盒使用说明书　　本试剂仅供研究使用　　目的：

本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中植物一氧化氮（NO）含量。

　　实验原理：

　　本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物一氧化氮（NO）水平。

用纯化的植物一氧化氮（NO）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物一氧化氮（NO）抗原，再与HRP标记的一氧化氮（NO）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的植物一氧化氮（NO）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，通过标准曲线计算样品中植物一氧化氮（NO）抗原浓度。

　　试剂盒组成：

试剂盒组成说明书封板膜密封袋酶标包被板标准品：

135ng/L标准品稀释液酶标试剂样品稀释液显色剂A液显色剂B液终止液浓缩洗涤液48孔配置1份2片1个1×48×1瓶×1瓶3ml×1瓶3ml×1瓶3ml×1瓶3ml×1瓶3ml×1瓶×1瓶96孔配置1份2片1个1×96×1瓶×1瓶6ml×1瓶6ml×1瓶6ml×1瓶6ml×1瓶6ml×1瓶×1瓶保存　　2-8℃保存2-8℃保存2-8℃保存2-8℃保存2-8℃保存2-8℃保存2-8℃保存2-8℃保存2-8℃保存　　标本要求：

　　1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融　　2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的活性。

　　操作步骤：

　　1.标准品的稀释与加样：

在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标　　准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，　　　　1　　　　2.　　3.4.5.6.7.8.9.10.11.　　混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。

。

　　加样：

分别设空白孔、待测样品孔。

在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

　　温育：

用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

　　配液：

将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

洗涤：

小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

　　加酶：

每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

温育：

操作同3。

洗涤：

操作同5。

　　显色：

每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.　　终止：

每孔加终止液50μl，终止反应。

　　测定：

以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。

测定应在加终止液后15分钟以内进行。

　　　　注意事项：

　　1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未　　用完，板条应装入密封袋中保存。

　　2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

　　3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。

一次加样时间最好　　控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

　　4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。

如标本中待测物质含量过高，请先用样品稀释液稀释一定倍数后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

　　7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

　　10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

　　　　　　2　　　　　　计算：

　　以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，　　在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD　　值标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释　　倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标　　准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值　　代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释　　倍数，即为样品的实际浓度。

　　　　　　　　　　　　　　试剂盒性能：

　　1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为以上。

2.批内与批见应分别小于9%和11%　　检测范围：

　　　　　　ng/L-120ng/L　　　　　　　　　　保存条件及有效期：

1.试剂盒保存：

；2-8℃。

2．有效期：

6个月　　　　3　　　　　　　　　　　　　　PlantNO　　FORRESEARCHUSEONLY　　DrugNames　　GenericName：

PlantNOELISAKit.　　Purpose　　ThiskitallowsforthedeterminationofNOconcentrationsinPlanttissue,cellandothersamples.　　Principleoftheassay　　ThekitassayPlantNOlevelinthesample，usePurifiedPlantNOantibodytocoat　　microtiterplatewells,makesolid-phaseantibody,thenaddNOtowells,CombinedantibodywhichWithHRPlabeled,becomeantibody-antigen-enzyme-antibodycomplex,afterwashingCompletely,AddTMBsubstratesolution,TMBsubstratebecomesbluecolorAtHRPenzyme-catalyzed,reactionisterminatedbytheadditionofasulphuricacidsolutionandthecolorchangeismeasuredspectrophotometricallyatawavelengthof450nm.TheconcentrationofNOinthesamplesisthendeterminedbycomparingtheofthesamplestothestandardcurve.　　4　　　　　　Materialsprovidedwiththekit　　MaterialsprovidedwiththekitUsermanualClosureplatemembraneSealedbagsMicroelisastripplateStandard：

135ng/LStandarddiluentHRP-ConjugatereagentSamplediluentChromogenSolutionAChromogenSolutionBStopSolutionwashsolution48determinations121196determinations1211Storage　　2-8℃2-8℃2-8℃2-8℃2-8℃2-8℃2-8℃2-8℃2-8℃×1bottle×1bottle3ml×1bottle3ml×1bottle3ml×1bottle3ml×1bottle3ml×1bottle×1bottle×1bottle×1bottle6ml×1bottle6ml×1bottle6ml×1bottle6ml×1bottle6ml×1bottle×1bottleSpecimenrequirements　　1.extractassoonaspossibleafterSpecimencollection,andaccordingtotherelevantliterature,andshouldbeexperimentassoonaspossibleaftertheextraction.Ifitcan’t,specimencanbekeptin-20℃topreserve,Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.2.Can’tdetectthesamplewhichcontainNaN3,becauseNaN3inhibitsHRPactive.　　Assayprocedure　　andaddsampletoStandard:

set10StandardwellsontheELISAplatescoated,addStandard100μltothefirstandthesecondwell,thenaddStandarddilution50μltothefirstandthesecondwell,mix;takeout100μlformthefirstandthesecondwellthenaddittothethirdandtheforthwellseparately.thenaddStandarddilution50μltothethirdandtheforth　　　　5

　　　　　　　　well,mix;thentakeout50μlfromthethirdandtheforthwelldiscard,add50μltothefifthandthesixthwell,thenaddStandarddilution50μltothefifthandthesixthwell,mix;takeout50μlfromthefifthandthesixthwellandaddtotheseventhandtheeighthwell,thenaddStandarddilution50μltotheseventhandtheeighthwell,mix;takeout50μlfromtheseventhandtheeighthwellandaddtotheninthandthetenthwell,addStandarddilution50μltotheninthandthetenthwell,mix,takeout50μlfromtheninthandthetenthwelldiscard（addSam