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标准文本食品安全标准

DBS22

DBS22/018-2012

食品安全地方标准

食品中肠球菌的检测方法

2012年发布2012年实施

───────────────────────────────

吉林省卫生厅发布

──────────────────────────────

前言

本标准根据GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：

标准的结构和编写规则》的要求编写。

本标准分为两种检测方法：

第1法：

肠球菌检验—常规培养方法

第2法：

肠球菌检验—固定酶底物法测定食品中肠球菌的方法。

《食品卫生微生物学检验肠球菌的检验》因现无国家标准，FDA、AOAC、USD也无标准方法。

因此参照了SN/T1933.1-2007《食品和水中肠球菌检验方法第一部分：

平板计数法和最近似值测定法》和国内杂志公开报道的肠球菌检验方法的文献。

该标准应用了VitekGNI＋全自动微生物免疫分析仪）或API20strep试剂条1（法国生物梅里埃公司）。

增加了固定酶底物法测定食品中肠球菌的方法。

本标准的附录A、附录B是规范性附录。

本标准负责起草单位：

吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心。

本标准负责起草人:

刘桂华、龚云伟、赵微、李月婷。

食品安全地方标准

食品中肠球菌的检测方法

1范围

　　本标准规定了食品中肠球菌（Enterococcus）的检验方法。

　　本标准适用于各类食品及食源性肠球菌病的检验。

2规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。

凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

　　GB/T4789.1食品卫生微生物学检验总则

　　GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂

3设备和材料

除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备与材料如下：

3.1冰箱：

0℃～4℃。

3.2恒温培养箱：

36℃±1℃、45℃±1℃。

3.3显微镜：

10×～100×。

3.4均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。

3.5天平：

0g～500g，精确至0.1g。

3.6灭菌试管：

18mm×180mm、15mm×100mm及相应的试管架。

3.7灭菌刻度吸管：

1mL、10mL。

3.8灭菌广口瓶:

500mL。

3.9灭菌培养皿：

90mm。

3.10酒精灯和接种环。

3.11剪刀、勺子、镊子。

3.12过滤装置及滤膜：

（0.6μm～2.0μm×0.6μm～2.5μm）。

3.13全自动细菌生化鉴定仪VITEK（生物梅里埃公司）。

4培养基和试剂

4.1叠氮化钠葡萄糖肉汤:

按附录第A.1。

4.2肠球菌肉汤:

按附录第A.2。

4.3KF链球菌琼脂:

按附录第A.3。

4.4肠球菌琼脂（胆汁七叶苷叠氮钠琼脂）:

按附录第A.4。

4.5胆汁七叶苷琼脂（BEA琼脂）:

按附录第A.5。

4.6脑心浸液肉汤:

按附录第A.6。

4.7含6.5%氯化钠脑心浸液肉汤:

按附录第A.7。

4.8脑心浸液琼脂:

按附录第A.8

4.9过氧化氢酶试验：

按附录第A.9。

4.14VitekGNI＋全自动微生物免疫分析仪）或API20strep试剂条1（法国生物梅里埃公司

1由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。

给出这一信息是为了方便本标本的使用者，并不表示对该产品的认可。

如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。

第一法常规培养方法

5检验程序

肠球菌的检验程序如下：

取适量样液用灭菌滤膜过滤

样品25g（ml）+

225mL0.85%生理盐水

紧贴在肠球菌

琼脂或KF琼脂

6操作步骤

6.1样品处理

6.1.1采样后应尽快进行检验，若不能及时检验，应放于－18℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验。

若不能及时检验，应冷藏保存的待检样品在运送实验室后应于1℃～4℃冰箱保存。

样品采集后8h内要完成检验。

6.2样品制备

6.2.1以无菌操作称取25g（或mL）检样放入含有225mL灭菌生理盐水的无菌均质杯或均质袋或灭菌乳钵中，均质（800～1000r/min）2min或拍击式均质器均质2min或充分研磨做成1:

10稀释液。

 若样品为液态或粉状，不需要均质，振荡混匀即可。

6.2.2取1:

10稀释液1mL加到含有10mL无菌生理盐水的稀释瓶中,充分混匀制成1:

100的稀释液。

按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10-5。

每个稀释度换用1支1mL灭菌吸管。

6.3定量检测

6.3.1平板计数法

此方法适用与样品未经加工处理的生鲜食品及肠球菌菌数大于10CFU/g（mL）的水和食品。

6.3.1.1接种和培养

取2个～3个连续的适宜稀释度的稀释液各1mL加入无菌培养皿内,每个稀释度做2个平皿。

把融化45℃±1℃的肠球菌琼脂或KF琼脂

12mL-15mL倾入培养皿内，转动平板充分混合，水平放置，使琼脂凝固。

肠球菌琼脂36℃±2℃24h培养；KF平板置36℃±2℃48h培养。

6.3.1.2菌落形态观察

肠球菌属细菌在肠球菌琼脂平板上形成带棕色环的棕黑色菌落；在KF平板上形成暗红色至粉红色菌落，边缘整齐；用灭菌接种针从每个肠球菌琼脂平板或KF平板挑取5个典型菌落。

进一步做确证实验。

6.3.1.3确证实验

典型菌落分别接种到脑心肉汤（BHIB）和葡萄糖琼脂斜面或脑心琼脂（BHIA）斜面，BHIB36℃±2℃24h培养,BHIA36℃±2℃48h培养。

BHIB肉汤培养24h后，每管肉汤培养物分别接种到胆汁七叶苷琼脂（BEA）平板、及含6．5%氯化钠的BHIB肉汤中。

BEA平板及含6．5%氯化钠的BHIB肉汤中36℃±2℃48h培养，观察细菌生长情况。

BEA平板上生长并水解七叶苷（形成黑色或棕色沉淀）6．5%氯化钠的BHIB肉汤中36℃±2℃48h培养生长良好。

具有以上特性的典型菌落可确证为肠球菌。

6.3.1.4菌落计数

计数后,从每个平板至少选取5个已计数的菌落进行确证实验，根据证实试验确定为肠球菌的菌落数,按比例计算出该皿内的肠球菌菌落数,然后计算同一稀释度两个平板的平均肠球菌数，再乘其稀释倍数再乘以10,即得样品中CFU/g（mL）所含肠球菌数并作出报告。

例:

将检样10-4稀释液1mL涂布于KF琼脂平板上,一块平板形成的可疑菌落数为65个,另一块平板形成的可疑菌落数为56个,各取5个进行鉴定,证实第一块平板肠球菌的是4个,第二块平板肠球菌的是5个,则1g（mL）样品中肠球菌数为[（65×4/5）+（56×5/5）]÷2×10-4＝5.4×10-5。

6.3.2最近似值（MPN）测定法

此方法适用于污染程度低的样品，检验含有受损伤的肠球菌的加工食品及肠球菌污染数小于100CFU/g（mL）的食品。

某些不适合用平板计数法的脱水淀粉类食品也可用此法检验。

6.4.2.1接种：

根据样品污染情况，选择能获得阴性终点的3个连续稀释度，每一稀释度分别接种三管叠氮化钠葡萄糖肉汤或肠球菌肉汤（SF肉汤）．每管接种1ml样液（如接种样液量为10ml．则应接种于双料SF肉汤管中），混匀后。

6.4.2.2培养：

叠氮化钠葡萄糖肉汤置36℃±1℃24h培养，检查各试管混浊情况；肠球菌肉汤36℃±1℃24h～48h培养；肉眼颜色变为黑色的试管，表明有肠球菌生长。

6.4.2.3确证试验：

对所有呈现混浊的叠氮化钠葡萄糖肉汤或颜色变为黑色的肠球菌肉汤进行确证试验。

用接种环将各管的培养物划线接种于肠球菌琼脂平板或KF琼脂平板，置36℃培养24h～48h。

肠球菌琼脂平板36℃±1℃24h培养；KF琼脂平板36℃±1℃48h培养。

对采用普通生化难以鉴定的可疑菌株,可以采用API试剂条或VITEK鉴定。

6.4.2.4肠球菌属细菌在肠球菌琼脂平板上形成带棕色环的棕黑色菌落；在KF平板上形成暗红色至粉红色菌落，边缘整齐。

用灭菌接种针从每个肠球菌琼脂平板或KF平板挑取5个典型菌落。

按6.3.1.3所述做进一步做确证实验。

6.4.2.5如一管培养物中所挑取的典型菌落中，有一个确认为肠球菌，则该管应视为阳性。

6.4.2.6根据接种的样品量和确证为肠球菌的阳性反应管数，查MPN值表（参见附录B）得出样品中肠球菌最近似值。

6.4.2.7结果报告

肠球菌MPN/g（mL）。

6.5.3滤膜法：

6.4.3.1倾注融化的4mL-5mL的肠球菌琼脂或KF琼脂于平板上，若平板表面有气泡，可用火焰灼除。

6.4.3.2根据样品的污染程度，使用样液的量为100，10，1.0，0.1或0.01mL。

使用灭菌滤膜过滤样液，以能在滤膜上生长出20个-100个菌落为宜。

6.4.3.3将滤过样液的滤膜紧贴在肠球菌琼脂或KF琼脂培养基表面上，避免出现气泡。

倒置平板于36℃培养48h。

6.4.3.4肠球菌属细菌在肠球菌琼脂平板上形成带棕色环的棕黑色菌落；在KF平板滤膜上形成暗红色至粉红色菌落。

将典型菌落接种于脑心浸液斜面上，36℃培养48h。

用其培养物做过氧化氢试验，过氧化氢浓度为3%，阳性反应者为非肠球菌细菌。

将阴性反应者接种于脑心浸液肉汤，置45.℃培养48h；同样方式接种一管胆盐肉汤，置36℃培养3d。

在上述两种情况下生长者为肠球菌。

选择生长20个-100个菌落的滤膜，根据所使用的样品量，计算出样品/g（mL）中的肠球菌菌数。

7结果计算：

7.1典型菌落计数和确认

7.1.1选择有典型肠球菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU～200CFU之间的平板，计数典型菌落数。

如果：

a）只有一个稀释度的平板菌落数在20CFU～200CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；

b）所有稀释度的平板菌落数均小于20CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；

c）某一稀释度的平板菌落数大于200CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；

d）若所有稀释度的平板菌落数大于200CFU且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；

e）若所有稀释度的平板菌落数均不在20CFU～200CFU之间且有典型菌落，其中一部分小于20CFU或大于200CFU时，应计数最接近20CFU或200CFU的稀释度平板上的典型菌落。

以上按公式

（1）计算。

f）若2个连续稀释度的平板菌落数均在20CFU～200CFU之间，按公式

（2）计算

7.1.2从典型菌落中至少挑取5个典型菌落（小于5个全选），划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30℃±1℃培养24h±2h。

7.2结果计数

公式

（1）：

T=

……………………………………………………………

（1）

式中：

T——样品中肠球菌菌落数；

A——某一稀释度肠球菌典型菌落的总数；

B——鉴定结果为肠球菌的菌落数；

C——用于肠球菌鉴定的菌落数；

d——稀释因子。

公式

（2）：

…………………………………………

（2）

式中：

T——样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；

A1——第一稀释度（低稀释倍数）肠球菌典型菌落的总数；

A2——第二稀释度（高稀释倍数）肠球菌典型菌落的总数；

B1——第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为肠球菌的菌落数；

B2——第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为肠球菌的菌落