临床荧光PCR结果分析及常见问题.docx

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临床荧光PCR结果分析及常见问题

临床荧光PCR结果分析及常见问题

中国人民解放军三零二医院王海滨

一、荧光PCR技术在临床诊、疗中的应用

PCR技术是于1983年由Mullis发明，后来传到我国，但是由于实验污染的问题，1998年卫生部取缔PCR实验方法在临床诊断中的应用。

荧光PCR出现后，污染减少很多，但近几年由于磁珠的应用，污染又再起。

2003年，PCR在SARS的早期诊断中非常有效，当时使用的是电泳法。

H1N1甲型流感（2009）：

荧光PCR技术作为确诊指标（755份/天）。

疾病易感基因的研究（SNP）：

CR1/丙型肝炎IL-28B。

疾病（肿瘤）易感基因的鉴定。

二、影响临床荧光PCR检测结果的因素

（一）影响临床荧光PCR检测结果的常见因素

1.检验因素：

实验室硬件、仪器、试剂、人员素质、技术水平、管理水平。

2.非检验因素：

标本采集、质量、部位、标本保存、条件、时间、标本中的干扰物质、样本丢失！

（二）加强检测前标本的质量管理——避免问题重复发生

规范标本前处理流程、制度化的重要性，建立不合格标本记录和定期总结制度、制定解决措施与可行路径（编号和项目错误等），查找标本丢失可能的环节。

加强本室新进工作人员流程培训，经常性进行临床医护的交流与培训。

（三）实验室分区

分为：

试剂配制、核酸提取、PCR扩增以及开放产物分析等区域。

分区目的：

通过物理分割达到标本、试剂或使用器具等被沾染或掺入污染，标本间的交叉污染等。

分区要求：

至少要有清洁的试剂配制和核酸制备区

三、试剂配制

（一）试剂配制室的设置与维护

以空间内无核酸气溶胶为准！

1．正压、清洁进风（壁挂式空调）。

试剂冰箱内勿存放病原或核酸相关物品！

定期清洁除霜！

2．有效氯消毒液清洁实验室台面、地面。

3．移液器：

使用前的清洁。

4．离心机等：

每周定期木浆纸巾擦拭，方法。

“一次性物品的使用-从COBAS的“浪费”中找到均衡！

（二）试剂配制注意事项

试剂配制实际是简单的问题，但是也是非常复杂的环节。

1.何时配制？

如何配制！

在核酸制备好后再进行试剂配制，注意反复冻溶对试剂质量的影响，以及久配不用试剂对检测的影响（如hot-TaqE）。

2.如何避免荧光淬灭？

避免在强光下配制，采用有效氯消毒液后应进行通风或清水擦拭，勿在紫外灯下配制。

3.交叉污染的避免

试剂与核酸何者先加更合理？

试剂分配中的问题：

过吸、残滴（第一孔）。

热盖不能完全阻止蒸发，石蜡油，盖、膜、离心。

（三）试剂配制环境对检测的影响

PPT8显示的是试剂配制环境对检测的影响，左边的图，是实验室在装修的时候用了一些油漆，在那个环境里面配制的试剂。

右边的图，是在无油漆环境下配制的。

可以看到左边的图结果很差。

（四）核酸制备

冻存标本使用前要混匀离心后使用；不同类型标本：

血清、血浆、细胞、组织、乳汁、痰液、尿液等；标本核酸提取前后的保存；提取后核酸的保存（稳定性）；核酸提取标本加入量与核酸得率的关系！

1+1与2的关系；指示剂的引入，可以降低差错率。

PPT10显示的是指示剂在一管法的应用，可以看到上面蓝色的是核酸提取液，非常清楚，降低了差错。

四、荧光PCR扩增

（一）实验室怎么建？

独立区域、负压通风、物品专用：

1.实验室清洁用品的专用的重要性。

2.扩增产物的处理（PCR管加盖、封膜、石蜡油），用两层封口袋包装后焚烧（如PPT12图）。

产物的处理必须由专业工作人员或经过培训的工作人员处理。

禁止未经培训的研究生、实习生和进修生进入区域对扩增产物进行操作。

3.仪器清洁处理程序：

载板区先用70%乙醇清洁。

该区所有垃圾需封闭运输并销毁。

4.地面和空气处理原则。

（二）荧光PCR仪器如何选择？

PCR实验室的仪器非常多有几十种，应按照实验的要求不同来进行选择。

（三）荧光PCR仪器如何维护？

荧光PCR仪器的功能模块分为三个：

1.温度模块

包含最基本的升降温。

要保证温度模块的均一性，既不能有边缘效应，也不能有局部温度的影响。

2.光学模块

即测光系统，PCR反应的过程中每一个循环都要测一次光，测光不论是照相还是扫描，都有一定的差别，光学模块的敏感性要高。

3.软件模块

荧光信号采集以后，要用软件模块来进行分析。

分析不但要人性化，而且还要准确，不能有故障。

（四）荧光PCR扩增循环数量的选择（60:

50:

40cycles）

COBASTAQMAN用的是60个循环，早期是40个循环，近几年的荧光PCR试剂，循环数有所增加，如丙肝增加到45个循环，乙肝42个循环。

PPT16显示的是实验室的图，扩增的循环数量是40个。

（五）质控品的设立-没有质控就没有质量保证

对一个完整的实验，一定要注意有空白对照，阴性对照与临界对照，临界对照是对精密度的考核。

另外，有平行定量标准品。

如果试验测的是血清，质控标准品也应该是血清，而不是人造核酸。

质控品在结果报告中的应用非常重要：

1.空白对照

一般放在第一孔的位置，监控扩增试剂及环境污染。

2.阴性对照

第二孔位置，监控核酸提取，试剂是否污染，可自行制备。

3.临界对照

实验室自行制作，是实验精确度需求。

4.等效定量标准品

中间位置或最后，实验准确性前提，参与核酸提取，标准范围宽。

（六）质控品的制作

HBVDNA：

介质的选择、临界质控的制作：

400IU/ML-50IU/ML；HCVRNA：

介质的选择、临界质控的制作：

3000IU/ML-100IU/ML；EBVDNA/CMVDNA/H1N1/HPV等定性试剂盒的质控，阳性标本，稳定性实验；质控品的朔源：

WHO标准或COBAS等；自建质控品：

建立数据记录（稳定性等）；室间质控与室内质控的有机结合！

（七）HBVDNA结果分析（质控在控与失控）

HBVDNA结果分析，就是荧光曲线的分析，要尽可能保证报告的数值，低限值和高于低限值的线要平行，尽可能不要失控。

临界质控品：

400IU/ml；基线的选择：

平均荧光值的3-7%；斜率：

保持在3.0-3.6（均值3.3）；相关系数：

r=0.999。

1.COBAS定量内标（QS）的失控

PPT21显示的是COBAS定量内标失控的情况。

2.不同定量区域QS值分布

PPT22显示的是不同定量区域QS的分布，例数是900多例。

如果内标出现了失控，定量值就无法参考了。

3.假阴性曲线的识别

在荧光PCR曲线里面，如果有荧光曲线是阴性、不规则的，要考虑是不是有干扰物质，在试剂配制或者标本里边有干扰物质。

此时需要复检。

五、实验室人员（与职称和学历无关）

（一）实验室人员分类

1.实习型：

按照操作说明进行操作，但环节控制、环节间衔接和防污染意识差！

2.工作型：

能够再现说明书操作要求，具有质量环节控制意识，具有一定的防污染常识，但发现问题和解决问题能力稍差。

3.示教型：

明晰试验操作的关键环节，并能够对下级工作人员进行演示和示教，具有完整的防污染意识、质量实现和一定的发现问题解决问题能力。

4.专家型：

能对商品试剂盒存在的问题进行改进，具有提前预知的质量意识。

（二）移液器的使用

移液器的使用，是小问题，大学问。

1.移液器加吸头的要点，需慢慢压，不能用力压。

2.不同量程移液器的应用要点（液体性质）。

3.移液器连续分液挂滴对实验的影响。

4.如何避免移液器连续分液导致的污染。

5.移液器吹打混匀带来的污染！

6.移液器的清洗，需要高压吗？

7.移液器的校准，很多单位无法实现。

（三）质量环节意识的培养（轮流当主任）

1.环节控制能力

质量环节的认知：

明晰实验操作环节的组成和目的！

关键环节的实现：

细节的严谨性与准确性！

环节的连贯性与细节实现：

实现完整实验！

2.防污染素质

实验室环境防污染意识：

具备科学防污染清洁意识和实现能力，如标本外溢的处理、实验室环境（空气、桌面、地面、移液器等）清洁，实验废物的管理和处理，离心机的清洁和维护等。

标本间交叉污染的预防意识和实现能力：

避免移液过程中的隐形迸溅污染（移液器）；试剂加样过程中的沾染污染；标准品的携带污染等。

扩增产物的外露污染：

产物回流预防能力；产物处理流程。

（四）人员的培养与专业技能比对

不同职务、职称和学历人员同时进行；环节操作与结果同时计分；比对结果记录在案并作为评聘指标。

六、试剂盒的质量与评价

（一）评价标准：

抗干扰-理论值与实际值的吻合。

1.特异性：

不同血清型对特异性的影响，抗污染性能和污染试剂

2.敏感性：

血清量、加样量对敏感性的影响（1+1=2？

）,试剂系统的组成与敏感性:

引物、探针序列的选择与用量，跨栏式试剂：

109-102IU/ml应处在线性范围内、且均存在荧光信号的上平台。

3.重复性：

取决于核酸提取方法与扩增效率。

（二）关于临界检测结果的漂移

例如，本场检测的时候，一个病人，一次检测是53IU，一次是<20IU，这都是漂移，这个技术方法性能本身，是正常的和合理的。

但这种漂移的原因，是试剂盒核酸提取的稳定性问题。

七、关于内标

（一）实时荧光定量PCR无需内标

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。

1.Ct值的重现性：

PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

2.Ct值与起始模板的线性关系：

由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准与标本同步进行核酸提取的曲线定量方法。

（二）内标对实时荧光定量PCR的影响

若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。

但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。

正因如此，定量方法虽然加入内标，仍为一种半定量方法。

美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：

内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。

AppliedBiosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。

（三）内标对PCR扩增的影响

PPT34显示的是内标对PCR扩增的影响。

左图，可以看到加入内标后线性范围变窄，无内标线性范围较宽。

右图，无内标时是直线，有内标后，变成曲线。

个人建议：

试剂盒在报批时，或使用单位对试剂盒质量进行评估时，使用内标对试剂盒性能进行评价！