临床荧光PCR结果分析及常见问题.docx
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临床荧光PCR结果分析及常见问题
临床荧光PCR结果分析及常见问题
中国人民解放军三零二医院王海滨
一、荧光PCR技术在临床诊、疗中的应用
PCR技术是于1983年由Mullis发明,后来传到我国,但是由于实验污染的问题,1998年卫生部取缔PCR实验方法在临床诊断中的应用。
荧光PCR出现后,污染减少很多,但近几年由于磁珠的应用,污染又再起。
2003年,PCR在SARS的早期诊断中非常有效,当时使用的是电泳法。
H1N1甲型流感(2009):
荧光PCR技术作为确诊指标(755份/天)。
疾病易感基因的研究(SNP):
CR1/丙型肝炎IL-28B。
疾病(肿瘤)易感基因的鉴定。
二、影响临床荧光PCR检测结果的因素
(一)影响临床荧光PCR检测结果的常见因素
1.检验因素:
实验室硬件、仪器、试剂、人员素质、技术水平、管理水平。
2.非检验因素:
标本采集、质量、部位、标本保存、条件、时间、标本中的干扰物质、样本丢失!
(二)加强检测前标本的质量管理——避免问题重复发生
规范标本前处理流程、制度化的重要性,建立不合格标本记录和定期总结制度、制定解决措施与可行路径(编号和项目错误等),查找标本丢失可能的环节。
加强本室新进工作人员流程培训,经常性进行临床医护的交流与培训。
(三)实验室分区
分为:
试剂配制、核酸提取、PCR扩增以及开放产物分析等区域。
分区目的:
通过物理分割达到标本、试剂或使用器具等被沾染或掺入污染,标本间的交叉污染等。
分区要求:
至少要有清洁的试剂配制和核酸制备区
三、试剂配制
(一)试剂配制室的设置与维护
以空间内无核酸气溶胶为准!
1.正压、清洁进风(壁挂式空调)。
试剂冰箱内勿存放病原或核酸相关物品!
定期清洁除霜!
2.有效氯消毒液清洁实验室台面、地面。
3.移液器:
使用前的清洁。
4.离心机等:
每周定期木浆纸巾擦拭,方法。
“一次性物品的使用-从COBAS的“浪费”中找到均衡!
(二)试剂配制注意事项
试剂配制实际是简单的问题,但是也是非常复杂的环节。
1.何时配制?
如何配制!
在核酸制备好后再进行试剂配制,注意反复冻溶对试剂质量的影响,以及久配不用试剂对检测的影响(如hot-TaqE)。
2.如何避免荧光淬灭?
避免在强光下配制,采用有效氯消毒液后应进行通风或清水擦拭,勿在紫外灯下配制。
3.交叉污染的避免
试剂与核酸何者先加更合理?
试剂分配中的问题:
过吸、残滴(第一孔)。
热盖不能完全阻止蒸发,石蜡油,盖、膜、离心。
(三)试剂配制环境对检测的影响
PPT8显示的是试剂配制环境对检测的影响,左边的图,是实验室在装修的时候用了一些油漆,在那个环境里面配制的试剂。
右边的图,是在无油漆环境下配制的。
可以看到左边的图结果很差。
(四)核酸制备
冻存标本使用前要混匀离心后使用;不同类型标本:
血清、血浆、细胞、组织、乳汁、痰液、尿液等;标本核酸提取前后的保存;提取后核酸的保存(稳定性);核酸提取标本加入量与核酸得率的关系!
1+1与2的关系;指示剂的引入,可以降低差错率。
PPT10显示的是指示剂在一管法的应用,可以看到上面蓝色的是核酸提取液,非常清楚,降低了差错。
四、荧光PCR扩增
(一)实验室怎么建?
独立区域、负压通风、物品专用:
1.实验室清洁用品的专用的重要性。
2.扩增产物的处理(PCR管加盖、封膜、石蜡油),用两层封口袋包装后焚烧(如PPT12图)。
产物的处理必须由专业工作人员或经过培训的工作人员处理。
禁止未经培训的研究生、实习生和进修生进入区域对扩增产物进行操作。
3.仪器清洁处理程序:
载板区先用70%乙醇清洁。
该区所有垃圾需封闭运输并销毁。
4.地面和空气处理原则。
(二)荧光PCR仪器如何选择?
PCR实验室的仪器非常多有几十种,应按照实验的要求不同来进行选择。
(三)荧光PCR仪器如何维护?
荧光PCR仪器的功能模块分为三个:
1.温度模块
包含最基本的升降温。
要保证温度模块的均一性,既不能有边缘效应,也不能有局部温度的影响。
2.光学模块
即测光系统,PCR反应的过程中每一个循环都要测一次光,测光不论是照相还是扫描,都有一定的差别,光学模块的敏感性要高。
3.软件模块
荧光信号采集以后,要用软件模块来进行分析。
分析不但要人性化,而且还要准确,不能有故障。
(四)荧光PCR扩增循环数量的选择(60:
50:
40cycles)
COBASTAQMAN用的是60个循环,早期是40个循环,近几年的荧光PCR试剂,循环数有所增加,如丙肝增加到45个循环,乙肝42个循环。
PPT16显示的是实验室的图,扩增的循环数量是40个。
(五)质控品的设立-没有质控就没有质量保证
对一个完整的实验,一定要注意有空白对照,阴性对照与临界对照,临界对照是对精密度的考核。
另外,有平行定量标准品。
如果试验测的是血清,质控标准品也应该是血清,而不是人造核酸。
质控品在结果报告中的应用非常重要:
1.空白对照
一般放在第一孔的位置,监控扩增试剂及环境污染。
2.阴性对照
第二孔位置,监控核酸提取,试剂是否污染,可自行制备。
3.临界对照
实验室自行制作,是实验精确度需求。
4.等效定量标准品
中间位置或最后,实验准确性前提,参与核酸提取,标准范围宽。
(六)质控品的制作
HBVDNA:
介质的选择、临界质控的制作:
400IU/ML-50IU/ML;HCVRNA:
介质的选择、临界质控的制作:
3000IU/ML-100IU/ML;EBVDNA/CMVDNA/H1N1/HPV等定性试剂盒的质控,阳性标本,稳定性实验;质控品的朔源:
WHO标准或COBAS等;自建质控品:
建立数据记录(稳定性等);室间质控与室内质控的有机结合!
(七)HBVDNA结果分析(质控在控与失控)
HBVDNA结果分析,就是荧光曲线的分析,要尽可能保证报告的数值,低限值和高于低限值的线要平行,尽可能不要失控。
临界质控品:
400IU/ml;基线的选择:
平均荧光值的3-7%;斜率:
保持在3.0-3.6(均值3.3);相关系数:
r=0.999。
1.COBAS定量内标(QS)的失控
PPT21显示的是COBAS定量内标失控的情况。
2.不同定量区域QS值分布
PPT22显示的是不同定量区域QS的分布,例数是900多例。
如果内标出现了失控,定量值就无法参考了。
3.假阴性曲线的识别
在荧光PCR曲线里面,如果有荧光曲线是阴性、不规则的,要考虑是不是有干扰物质,在试剂配制或者标本里边有干扰物质。
此时需要复检。
五、实验室人员(与职称和学历无关)
(一)实验室人员分类
1.实习型:
按照操作说明进行操作,但环节控制、环节间衔接和防污染意识差!
2.工作型:
能够再现说明书操作要求,具有质量环节控制意识,具有一定的防污染常识,但发现问题和解决问题能力稍差。
3.示教型:
明晰试验操作的关键环节,并能够对下级工作人员进行演示和示教,具有完整的防污染意识、质量实现和一定的发现问题解决问题能力。
4.专家型:
能对商品试剂盒存在的问题进行改进,具有提前预知的质量意识。
(二)移液器的使用
移液器的使用,是小问题,大学问。
1.移液器加吸头的要点,需慢慢压,不能用力压。
2.不同量程移液器的应用要点(液体性质)。
3.移液器连续分液挂滴对实验的影响。
4.如何避免移液器连续分液导致的污染。
5.移液器吹打混匀带来的污染!
6.移液器的清洗,需要高压吗?
7.移液器的校准,很多单位无法实现。
(三)质量环节意识的培养(轮流当主任)
1.环节控制能力
质量环节的认知:
明晰实验操作环节的组成和目的!
关键环节的实现:
细节的严谨性与准确性!
环节的连贯性与细节实现:
实现完整实验!
2.防污染素质
实验室环境防污染意识:
具备科学防污染清洁意识和实现能力,如标本外溢的处理、实验室环境(空气、桌面、地面、移液器等)清洁,实验废物的管理和处理,离心机的清洁和维护等。
标本间交叉污染的预防意识和实现能力:
避免移液过程中的隐形迸溅污染(移液器);试剂加样过程中的沾染污染;标准品的携带污染等。
扩增产物的外露污染:
产物回流预防能力;产物处理流程。
(四)人员的培养与专业技能比对
不同职务、职称和学历人员同时进行;环节操作与结果同时计分;比对结果记录在案并作为评聘指标。
六、试剂盒的质量与评价
(一)评价标准:
抗干扰-理论值与实际值的吻合。
1.特异性:
不同血清型对特异性的影响,抗污染性能和污染试剂
2.敏感性:
血清量、加样量对敏感性的影响(1+1=2?
),试剂系统的组成与敏感性:
引物、探针序列的选择与用量,跨栏式试剂:
109-102IU/ml应处在线性范围内、且均存在荧光信号的上平台。
3.重复性:
取决于核酸提取方法与扩增效率。
(二)关于临界检测结果的漂移
例如,本场检测的时候,一个病人,一次检测是53IU,一次是<20IU,这都是漂移,这个技术方法性能本身,是正常的和合理的。
但这种漂移的原因,是试剂盒核酸提取的稳定性问题。
七、关于内标
(一)实时荧光定量PCR无需内标
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。
1.Ct值的重现性:
PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。
2.Ct值与起始模板的线性关系:
由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准与标本同步进行核酸提取的曲线定量方法。
(二)内标对实时荧光定量PCR的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标,则PCR反应变为双重PCR,双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争,尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时,这种竞争会表现得更为显著。
但由于待测样品的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。
正因如此,定量方法虽然加入内标,仍为一种半定量方法。
美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较,得出的结论是:
内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的,而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。
AppliedBiosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金标准,可实现多色荧光同时检测,但定量检测仍然采用外标准曲线的方法,而不用内标进行定量。
(三)内标对PCR扩增的影响
PPT34显示的是内标对PCR扩增的影响。
左图,可以看到加入内标后线性范围变窄,无内标线性范围较宽。
右图,无内标时是直线,有内标后,变成曲线。
个人建议:
试剂盒在报批时,或使用单位对试剂盒质量进行评估时,使用内标对试剂盒性能进行评价!