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RNA分子抗SARS病毒的应用和研究进展

严重急性呼吸综合征（Severeacuterespiratorysyn-drome,SARS）又称传染性非典型肺炎,是一种严重急性呼吸系统传染病,系由SARS相关冠状病毒（Severeacutere-spiratorysyndromeassociatedcoronavirus,SARS-CoV）引起的新发传染病[1]。

SARS-CoV是单股正链RNA病毒,呈现典型冠状病毒基因组结构特征:

5′-复制酶基因-S基因-E基因-M基因-N基因-3′以及5′和3′端非编码区[2]。

SARS-CoV侵入宿主细胞后,首先以病毒基因组RNA为模板,翻译自身RNA依赖的RNA聚合酶,然后利用这种聚合酶完成病毒负链亚基因组RNA转录、各结构蛋白的mRNA转录以及病毒基因组RNA复制等病毒粒增殖过程中的一系列环节[3]。

目前SARS治疗的主要策略有广谱抗生素、抗病毒剂和免疫调制疗法,但是很少的药物能够有效的对抗病毒[4],因而对抗SARS治疗而言,改进治疗方案、开发更加特异性的药物和更有效的疗法十分重要。

基于核酸的基因调控分子是长度约20个碱基的人工合成性单链或双链DNA或RNA,这些分子包括核酸配体、反义寡核苷酸、核酶和小干扰性RNA,这些分子以序列特异性方式针对细胞或病毒的mRNA,造成靶mRNA断裂和/或阻断靶mRNA的转录与翻译起始,因此成为基因功能分析和抗病毒药物开发的有力工具。

本文就这些不同类型RNA分子在抗SARS病毒的应用及机制研究的进展进行综述。

1　RNA适配子在抗SARS-CoV中的应用

适配子（aptamer）是能与多种目标分子以高亲和力和高特异结合的核酸序列,从原始文库中筛选与配体相对应的适配子的技术称为指数级富集配体系统进化技术,即SELEX（Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrich-ment）[5-7]。

用于抗病毒的适配子是以病毒基因表达调控有关的蛋白酶和关键基因作为主要靶点,如SARS-CoV的3CL蛋白酶和NTPase/解旋酶,还有双链RNA/DNA解旋、RNA加帽活性中的关键基因均是理想的抗病毒靶点[8]。

目前已经利用SELEX技术从多种文库中筛选到能够有效抑制解旋酶活性的适配子。

Jang等[9]筛选出针对SARS-CoV的非结构蛋白nsP10的RNA适配子,可以有效抑制解旋酶的活性。

然而,天然RNA在体内的稳定性差,极易被体内各种RNA核酸酶降解,故难以在体内应用。

Shum等[10]筛选到G-四倍体和非G-四倍体两种构象的适配子。

但是仅非G-四倍体能够特异性地抑制病毒解旋酶活性,而G-四倍体却不能。

原因在于非G-四倍体经生物素或反向胸腺嘧啶修饰后在血清中的稳定性增强,这种结构性选择及对稳定性的修饰作用为寻找解旋酶适配子提供了新线索。

适配子具有靶分子范围广、亲和力和特异性高、稳定性好、制备方便等优点。

随着对SARS-CoV感染复制机制的深入研究以及核酸适配体技术的发展,一些有效且低毒的适配体分子被筛选出来,为抗SARS治疗带来了希望,但是核酸适配子易被体内的核酸酶降解,因此它的修饰,转移进细胞等方面也需要进一步研究。

2　反义RNA在抗SARS-CoV中的应用

反义寡核苷酸（Antisenseoligonucleotide,ASON）指能够以碱基配对方式与特定DNA和RNA结合并阻止它们转录和翻译的短核酸片段（反义链片段）。

反义RNA与mR-NA的特异性互补结合可以抑制后者的翻译。

最早于大肠杆菌的产肠杆菌素的ColE1质粒中发现通过反义RNA控制mRNA翻译,后来许多实验证明在真核生物中也存在反义RNA[11]。

就反义RNA抗病毒方面的研究而言,早在1978年就有报道表明反义寡核苷酸可以抑制劳氏肉瘤病毒的复制[12]。

利用反义RNA能与特定的RNA病毒作用,直接抑制这些病毒的复制,从而阻断RNA病毒的繁殖,达到抗病毒性疾病的目的。

ASON在抑制SARS-CoV蛋白表达的实际应用中,主要通过化学修饰法来提高ASON的稳定性,体外试验证明硫代修饰的ASON能够下调SARS-CoV结构蛋白E、M、N的表达量[13]。

而3′端修饰的ASON能够抑制SARS-CoV突起蛋白（SpikeProtein,SP）的mRNA的表达水平[14]。

在抗病毒剂中广泛研究的肽缀合反义吗啉代寡聚体（Peptide-conjugatedantisensemorpholinooligomers,P-PMO）具有更强的反义作用,针对SARS-CoV5′UTR中转录调控序列合成的P-PMO可以减少病毒诱导的细胞病理学并减慢病毒在细胞间的扩散[15]。

利用与SARS-CoV种系关系很近的鼠科肝炎病毒（MHV）在体内建立感染模型,显示与MHV病毒基因组RNA5′端配对的P-PMO可以减少病毒复制和小鼠组织损伤,但是这种P-PMO也具有潜在毒性[16]。

Krahling等用磷酰二胺吗啉修饰的PPMO可以抑制细胞凋亡[17]。

而感染细胞的抗凋亡水平的升高能够减少细胞的自杀现象[18]。

反义核酸技术原理简单、前景诱人,在基础研究及抗病毒的研究中都显示出很大的优势和潜力,在抗SARS的治疗中也有潜在的应用价值,但在实际使用中还存在一些不容忽视的问题,如许多ASONs缺乏特异性且具有免疫刺激性和激活补体的毒副作用,这些都需要我们寻找更有效的途径来改造和更新原有的思路,才能使它作为分子药物不断深入的研究。

3　核酶在抗SARS-CoV中的应用

核酶是一类本身具有酶剪切活性的RNA,能够以序列特异性方式催化靶RNA的切割。

迄今发现的核酶从结构上主要分为两大类:

锤头型核酶和发夹型核酶。

核酶与反义RNA不同,它们具有催化活性,无免疫原性,在应用上可能比反义药物具有更大的潜力,因此越来越广泛地应用于基因研究与治疗各领域。

体内和体外实验已经证明了核酶可以抑制HIV、HBV、HCV病毒的复制,近几年也逐渐开始了动物水平的评价,已经批准核酶在抗HIV和癌症方面进行临床试验[19-21]。

Mizutani等报道了核酶与同源于SARS-CoV的病毒MHV的相互作用,其中与MHV基因组RNA的5′端结合的核酶能够抑制MHV增殖[22]。

Maeda等合成了与MHV的RNA聚合酶特异结合的两种锤头型核酶:

S-核酶和L-核酶,能够使感染的子代病毒颗粒大量减少,尽管S-核酶剪切RNA的过程比L-核酶慢,但是这两种核酶的作用效果是相同的[23,24]。

然而,如何获得高效、无毒的特异性核酶,如何选择靶序列中最佳切割位点,如何提高核酶进入靶细胞的效率并稳定发挥作用等问题对核酶今后的应用和发展提出了新的挑战。

因此,不断采取新的设计策略,提高核酶的切割效率,通过人工筛选或修饰手段构建新的人工核酶并扩大核酶催化反应谱将成为核酶研究的主要内容之一。

虽然核酶抗SARS-CoV的作用仍在研究中,至今还没有明确结果,但是通过研究它对SARS-CoV种系很近的病毒的作用,可以推测核酶在抗SARS-CoV基因治疗中的潜在效果,为预防和治疗SARS又开拓了一条可行之路,很可能成为未来抗病毒研究的热点。

4　siRNA在抗SARS-CoV中的应用

RNAi（RNAinterference,RNAi）最早在研究秀丽新小杆线虫（C·elegans）反义RNA的过程中发现[25]。

在生物体内,双链RNA被核糖核酸酶切割成长度21-23nt的小干扰性RNA（smallinterferingRNA,siRNA）,它能与特定mR-NA结合引起其降解而导致基因沉默。

有关报道显示,siR-NA在细胞和动物水平均可以有效抑制病毒复制[26,27]。

siRNA比ASON具有更强的优势和潜力,为研究抗SARS病毒感染过程提供了新的研究工具并且已成为当前的研究热点之一。

众多研究者确定了针对SARS-CoV基因组的siRNA作用的不同靶位点,并在体外实验和动物实验中利用这些靶位点通过RNAi方法展示了高效的抗病毒作用。

在体外细胞实验中证实与SARS-CoV的S蛋白特异结合的siRNA能够降低S蛋白的表达,并且在动物实验中证明siRNA的作用能够减轻发病症状[28,29]。

目前广泛应用化学合成和重组质粒法产生siRNA。

以病毒RNA聚合酶基因为靶点的siR-NA重组表达质粒转入细胞后能够降低病毒RNA和病毒蛋白的表达水平,从而抑制病毒复制[30]。

与SARS-CoV的非结构蛋白NSP1序列特异性结合的质粒表达型siRNA可以使感染后的细胞病变减轻、活细胞显著增加、病毒空斑明显减少[31]。

化学合成法因其合成效率更高,吸引了更多研究者的关注。

由于对靶基因不同部位的siRNA具有不同的干扰效率,故需要对设计的siRNA进行筛选。

Zheng[32]等从化学合成法产生的48条针对SARS-CoV基因组中各基因编码区的siRNA筛选到4种有效抑制靶基因的分子,并且联合应用可以显著提高对靶基因表达的抑制效应。

同样,Shi等化学合成针对SARS-CoV中E、M和N蛋白基因的siRNA能使各个靶基因的表达水平降低80%[33]。

Wu等合成的针对SARS-CoV前导序列、TRS、5′-UTR和SP序列的siRNA能够抑制SARS-CoV复制[34]。

同时,体外实验证实了针对SARS-CoV前导序列的siRNA的抑制强度高于针对S基因的siRNA和反义寡核苷酸[35],这两组结果说明前导序列可以作为有效靶点。

尽管众多研究以病毒基因组中的全长ORF作为研究SARS-CoV病毒复制的主要对象,但是实验证明亚基因组RNAs（subgeomicRNA,sgRNA）对病毒的复制增殖也很重要。

以SARS-CoVsgRNA设计的siR-NA能够抑制病毒蛋白的表达,使子代病毒的增殖明显减少[36]。

在RNAi作用过程中,siRNA的稳定性和特异性很重要。

利用具有高亲和力的核苷酸类似物-锁定核酸（LockedNucleicAcid,LNA）修饰siRNA后,使其在血清中的稳定性大大提高,并且对靶基因作用效率高于未修饰的siRNA[37]。

siRNA逐渐成为抗病毒治疗研究领域的热门工具,为开发可以预防和治疗SARS的潜在药物创造了条件。

在siRNA的应用过程中,怎样设计出有效的siRNA序列,如何有效地将siRNA分子有效的转移到靶器官并进入靶细胞,怎样提高siRNA的稳定性等问题还需解决。

但是关于siRNA的许多研究结果使大家深信,siRNA是非常有希望被应用于临床的。

5　结语

已知新型冠状病毒SARS-CoV是引起严重急性呼吸道综合征（SARS）的病原体,目前尚无有效的针对性预防和治疗药物。

随着分子生物学的进展,基因治疗成为新的抗病毒策略。

RNA相关的抗病毒策略能够针对病毒基因组而对宿主的影响较小,因而在近期的抗SARA治疗中得到广泛关注,也取得了很大的进展。

SARS-CoV基因组测序已经完成,对病毒的分子生物学特性有了一定了解,针对病毒复制、增殖相关的主要序列为靶点设计的RNA适配分子、反义核酸、核酶、siRNA能够有效的抑制SARS-CoV的复制,现在成为医学和生物学研究的前沿和热点。

本文主要阐述了RNA相关分子抗病毒机制取得的一些最新进展,国内外的科学家合成筛选出很多基于RNA的基因调控分子,体内体外实验均有抗SARS病毒的作用。

但是这些相关技术仍然需要克服核酸类化合物的固有限制性,如将合成的目的序列导入细胞的方法、在细胞内的稳定性、如何避免脱靶现象和非特异性反应以及获得高疗效等。

尽管还有很多工作要做,但是这些RNA相关生物技术的研究结果已经显示了诱人的前景,为研究抗SARS病毒药物提供了可行性,具有广阔的应用前景和临床实用价值。

参考文献:

[1]MarraMA,JonesSJ,AstellCR,etal·Thegeno