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硕士论文
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5.稿件研究方法和内容比较粗糙，没有重复试验和数据统计
6.电泳图谱模糊不清，且没有标明条带对应的样品。
小麦胚芽清蛋白提取工艺及分子量测定
摘要：
小麦胚芽清蛋白是一种优质蛋白质，为了充分开发利用小麦胚芽资源，通过单因素试验和正交试验对清蛋白提取工艺进行了研究，得到最佳提取条件为粉碎粒度0.125mm，提取温度30℃，提取时间30min，提取料液比1︰11，此条件下提取清蛋白占麦胚蛋白29.2%。
清蛋白SDS-PAGE凝胶电泳包含7条条带，分子量分别为20.89、28.84、38.02、43.65、51.29、60.26、72.44Ku.此方法实现了对小麦胚芽清蛋白最大程度的提取。
关键词：
小麦胚芽,清蛋白,提取率,电泳
Extractiontechniqueofwheatgermalbuminanddeterminationofmolecularweight
DIAODa-peng1,HUANGJi-hong1,2*,lIJin3,HOUYin-chen2
（1.He,nanUniversityofTechnology,Zhengzhou450001,China2.He,nanprovinceFoodIndustryResearchInstitution,Zhengzhou450000,China3.HenanCaixincompany.Dancheng477150,China）
Abstract:
Wheatgermalbuminisaniceprotein.Todevelopwheatgermdeeply,theexperimentresearchitsextractiontechniquebysingle-factorexperimentandorthogonalexperiment.Theoptimalextractionconditionismeshnumber0.125mm,temperature30℃,time30min,solid-liquidratio（g/ml）1︰11.Inthiscondition,theratioofextractedwheatgermalbumininwheatgermproteinis29.2%.SDS-PAGEElectrophoresisofalbumincontainssevenbands.Molecularweightsare20.89、28.84、38.02、43.65、51.29、60.26、72.44Ku.Bythisway,wheatgermalbuminisextractedsufficiently.
Keywords:
wheatgerm；albumin；extractionefficiency；electrophoresis
小麦胚芽占小麦籽粒的2％～3％，是小麦的生命源泉，是整个麦粒营养价值最高的部分[1]，被营养学家誉为“人类天然的营养宝库”[2-3]。
麦胚中的总蛋白含量高达30％左右，是一种完全蛋白，它含有人体必需的8种氨基酸[4,5]，占总氨基酸的34.74％[6]，而且必需氨基酸的相互比值与FAO/WHO颁布的模式基本接近[7,8]。
小麦胚芽各种蛋白质中，清蛋白评分最高，具有最高的蛋白质效率比（PER）、体外消化率（IVPD）和较好的氨基酸组成，是一种优质蛋白质[9,10]。
小麦胚芽虽然具有高的营养价值，但因其高色泽和脂肪酶含量，混入面粉会降低面粉白度，不利于面粉贮藏，在制粉中被去除掉[11,12]，造成了资源的严重浪费。
为充分地开发利用小麦胚芽清蛋白资源，朱科学、纪莹优化了清蛋白提取pH、料水比、温度、时间[13]，周惠明研究了水溶性蛋白中的糖蛋白性质[14-15]。
本文对小麦胚芽清蛋白提取时的粉碎粒度、料水比、温度、时间进行了研究，并在此基础上制得蛋白含量较高的清蛋白粗粉及精粉，通过SDS-PAGE凝胶电泳测定了组成清蛋白亚基分子量，为进一步开发清蛋白提供了参考。
1材料与方法
1.1实验材料与实验器材
新鲜小麦胚芽河南财鑫集团第二制糖厂;BM523蛋白电泳Marker生工生物工程有限公司；硫酸铵、冰乙酸、氯化钠、Tris、Acr、Bis、SDS、TEMED、甘氨酸、过硫酸铵、蔗糖、巯基乙醇、溴酚蓝、考马斯亮蓝、甲醇。
THZ-100B摇床上海-恒科学仪器有限公司；L-55台式低速大容量离心机湖南湘仪实验仪器开发有限公司；XY-200型高速多功能粉碎机浙江省永康市松青五金工具厂；反渗透膜系统福建赛普特膜技术有限公司；DYY-III型电泳槽和DYY-III2稳压稳流电泳仪北京市六一仪器厂；23-10箱式电阻炉北京市永光明医疗仪器厂；LGJ-10台式冷冻干燥机北京松源华兴科技发展有限公司；索氏提取仪、凯氏定氮仪。
1.2实验方法
1.2.1水分含量测定按GB5009.3-2010
1.2.2灰分测定按GB5009.4-2010
1.2.3蛋白质含量测定及提取率计算
蛋白质含量测定按GB5009.5-2010
蛋白质提取率=提取液中蛋白质含量/小麦胚芽中蛋白含量
1.2.4油脂含量测定按GB/T10359-2008
1.2.5小麦胚芽灭酶:
小麦胚芽放于80℃烘箱10min灭酶。
1.2.6小麦胚芽脱脂:
小麦胚芽粉碎粒度至0.42mm，放入玻璃容器中，按料液比1︰1加入正己烷，保鲜膜封口，浸提4小时，每30min搅拌一次。
浸提结束，进行抽滤。
抽滤后液体部分蒸发溶剂提油，脱脂麦胚平铺白色瓷盘，放入通风厨内脱溶12小时备用。
1.2.7清蛋白提取实验
粉碎粒度对提取率影响：
将脱脂麦胚粉（粉碎粒度0.42mm）继续粉碎至粒度0.178、0.125、0.096、0.074mm,按1︰11料液比分别装入500mL三角瓶，调pH7.0。
每个三角瓶装胚芽干基40g蒸馏水280mL，于30℃摇床100r/min提取30min，迅速抽滤，测定滤液蛋白质含量,，计算提取率。
温度对提取率影响：
取粒度为0.074mm小麦胚芽粉，按1︰11料液比分别装入500mL三角瓶，调pH7.0。
每个三角瓶装胚芽干基40g,加蒸馏水280mL，于10,20,30,40,50℃摇床100r/min提取30min，迅速抽滤，测定滤液蛋白质含量，计算提取率。
提取时间对提取率影响：
取粒度为0.074mm小麦胚芽粉，按1︰11料液比分别装入500mL三角瓶，调pH7.0。
每个三角瓶装胚芽干基40g,加蒸馏水280mL，提取温度30℃，摇床100r/min，分别提取10,20,30,40,50min，迅速抽滤，测定滤液蛋白质含量，计算提取率。
提取料液比对提取率影响：
取粒度为0.074mm小麦胚芽粉，按1︰7、1︰9、1︰11、1︰13、1︰15料液比分别装入500mL三角瓶，调pH7.0。
每个三角瓶装胚芽干基40g,，加蒸馏水280mL，提取温度30℃，摇床100r/min,提取30min,,迅速抽滤，测定滤液蛋白质含量，计算提取率。
1.2.8正交实验：
以粉碎粒度，提取温度，提取时间，提取料液比四因素，设计4因素3水平正交实验。
因素与水平见表1：
表1小麦胚芽清蛋白提取工艺正交实验因素与水平表
Table1FactorsandleveltableofOrthogonalexperimentalofwheatgermalbuminextractiontechnology
水平
A粒度/mm
B温度/℃
C时间/min
D料液比
1
0.125
10
10
1:
7
2
0.096
20
20
1:
9
3
0.074
30
30
1:
11
1.2.9清蛋白粉制作：
将清蛋白提取液进一步加工可得两种蛋白含量不同的清蛋白粉：
反渗透膜脱盐至5%以下，喷雾干燥，得到清蛋白粗粉；加入一定量硫酸铵，配成硫酸铵饱和溶液，沉淀出清蛋白，4000r/min离心10min后，取沉淀，将沉淀在水中溶解后，用反渗透膜脱盐至5%以下，得到清蛋白浓缩液，冷冻干燥得清蛋白精粉。
1.2.10清蛋白电泳：
对清蛋白提取液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，确定其分子量。
2实验结果与分析
2.1新鲜小麦胚芽灭酶脱脂前后成分见表2
表2小麦胚芽成分
Table2Compositionofwheatgerm
成分
水分含量
灰分含量
油脂含量
蛋白含量
脱脂前含量
10.2%
4.1%
10%
30.5%
脱脂后含量
11.2%
4.5%
1.2%
33.2%
2.2不同粒度对小麦胚芽蛋白提取率的影响
由提取率与粒度曲线图1知，随麦胚粉碎粒度减小，清蛋白提取率增加，是由于粉碎粒度越小，比表面积越大，清蛋白浸出越充分。
粒度由0.125mm增大到0.42mm时，提取率下降明显，而由0.074mm增大到0.125mm时，提取率下降不明显。
因为粉碎粒度越小，能耗越大，因此选取的粉碎粒度为0.125mm。
图1粒度对提取率影响
Fig.1Inflanceofgrainsizetoextractionratio
2.3不同温度对提取率影响
由图2知提取温度从10℃升至30℃过程中，提取率显著增加。
温度由30℃继续升高，提取率急剧下降，是因为超过30℃，接近了清蛋白变性温度，部分清蛋白变性沉淀而留于滤渣中。
因此宜选取提取温度30℃。
图2提取温度对提取率影响
Fig.2Inflanceoftempraturetoextractionratio
2.4提取时间对提取率的影响
图3提取时间对提取率影响
Fig.3Inflanceoftimetoextractionratio
由图3可知，前30min内，延长提取时间延长，蛋白提取率明显增加，超过30min,，提取时间继续延长，提取率几乎不变。
节约时间起见，宜选取提取时间为30min。
2.5料液比对提取率的影响
由图4知，料液比由1︰7到1︰11过程中，清蛋白提取率增加明显。
料液比继续增加，提取率增加不明显，逐渐保持不变。
为节水起见，宜选用料液比1︰11
图4提取料液比对提取率影响
Fig.4Inflanceofsolid-liquidratiotoextractionratio
2.6正交实验设计
根据表1因素与水平设计L9（34）正交表及实验数据如下：
表3小麦胚芽清蛋白提取工艺正交实验结果
Table3Orthogonalexperimentalresultsofwheatgermalbuminextractiontechnology
试验号
A
B
C
D
提取率/%
1
1
1
1
1
22.1
2
1
2
2
2
26.6
3
1
3
3
3
29.2
4
2
1
2
3
26.4
5
2
2
3
1
26.8
6
2
3
1
2
26.3
7
3
1
3
2
26.5
8
3
2
1
3
26.7
9
3
3
2
1
28.2
K1
78.0
75.0
75
77.1
K2
79.5
80.1
81.3
79.5
K3
81.3
83.7
82.5
82.2
k1
26.0
25.0
25.0
25.7
k2
26.5
26.7
27.1
26.5
k3
27.1
27.9
27.5
27.4
R
1.1
2.9
2.5
1.7
粒度/mm温度/℃时间/h料液比
图5小麦胚芽清蛋白提取正交实验直观图
Fig.5VisualizeddiagramofOrthogonalexperimentalofwheatgermalbuminextractiontechnology
由正交实验表2和极差直观图5知，对清蛋白提取影响由大到小各因素排序为温度＞时间＞料液比＞粒度。
由于粉碎粒度对提取率影响与其它三项相比不明显，且增加粉碎粒度需增加能耗和时间，因此粉碎粒度选择0.125mm。
综合以上结果得到清蛋白提取的最佳因素配比为麦胚粉碎粒度0.125mm，提取温度30℃，提取时间30min，提取料液比1︰11，提取率可达29.2%。
2.7清蛋白粗粉
1kg脱脂小麦胚芽制得清蛋白粗粉290g,其中蛋白含量37%。
其它成分大多为可溶性糖。
2.8清蛋白精粉
1kg脱脂小麦胚芽制得清蛋白精粉148.5g,其中蛋白含量高达72%。
蛋白中包含30%糖蛋白，糖蛋白含糖基占糖蛋白总重的43%。
2.9清蛋白SDS-PAGE电泳
清蛋白Marker
图6清蛋白SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳图
Fig.6AlbuminSDS-PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresisfigure
图7清蛋白SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量对数与相对迁移率曲线图
Fig.7SDSelectrophoreticrelativemolecularmassofthelogarithmicandrelativemigrationratecurvefractions
表4SDS-PAGE标准曲线数据表
Table4SDS-PAGEStandardcurvedatatable
Marker/Ku
14.4
31
42.7
66.2
97.4
分子量对数
1.158
1.49
1.63
1.821
1.989
相对迁移率/mm
27
49
58
65
73
注：
条带由下至上排列
表5SDS-PAGE清蛋白分子量表
Table5SDS-PAGEalbuminmolecularweighttable
相对迁移率/mm
21
29
38
44
51
60
72
分子量对数
1.32
1.46
1.58
1.64
1.71
1.78
1.86
分子量/Ku
20.89
28.84
38.02
43.65
51.29
60.26
72.44
注：
条带由下至上排列
由SDS-PAGE电泳图6可知，清蛋白共呈现7条谱带。
由蛋白Marker分子量对数与相对迁移率（此处相对迁移率指电泳谱带到电泳前沿的距离，清蛋白谱带相对迁移率与之相同）数据表4作标准曲线图7，得分子量对数与相对迁移率关系式y=0.0179x+0.6441,，R2=0.9846。
将清蛋白条带相对迁移率带入公式，得到清蛋白分子量对数，进而得到清蛋白分子量见表5。
清蛋白7条谱带分子量由小到大排列分别为20.89、28.84、38.02、43.65、51.29、60.26、72.44Ku。
3结论
通过单因素试验和正交试验优化了小麦胚芽清蛋白提取最佳工艺条件，即粉碎粒度0.125mm。
提取温度30min，提取时间30min，提取料液比1︰11。
此条件下清蛋白提取率达29.2%。
将清蛋白提取液纯化喷雾干燥得清蛋白粗粉，清蛋白含量37%；对清蛋白提取液进一步提取纯化后真空冷冻干燥得清蛋白精粉，清蛋白含量72%。
通过对清蛋白提取液进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳得到7条谱带，分子量由小到大分别为7.31、9.2、19.23、27.79、33.41、52.95、83.93Ku。
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