浅论FHIT基因过表达对人胃癌细胞系MKN.docx
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浅论FHIT基因过表达对人胃癌细胞系MKN
浅论FHIT基因过表达对人胃癌细胞系MKN
【摘要】 目的探讨FHIT基因过表达对人胃癌细胞系MKN-45增殖和粘附能力的影响。
方法将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒转染FHIT基因mRNA阴性表达人胃癌细胞系MKN-45,分别用MTT法、平板克隆形成实验、黏附实验检测转染前后细胞增殖活性、克隆形成能力及粘附能力的变化。
结果FHIT基因的过表达可降低MKN-45细胞的增殖和克隆形成能力,但是对MKN-45细胞与内皮细胞的粘附能力无明显影响。
结论FHIT基因过表达可抑制人胃癌细胞系MKN-45的增殖和克隆形成,对于MKN-45细胞与内皮细胞的粘附能力无明显影响。
【关键词】FHIT胃肿瘤细胞增殖克隆分子基因转染细胞粘附
Abstract:
ObjectiveToevaluatetheeffectsofFHITgeneover-expressiononhumangastriccancercelllineMKN-45proliferationandadhesion.MethodsHumanxenogenouseukaryoticexpressionplasmid weretransfectedtomRNA-negativehumangastriccelllineMKN-45.AMTTassay,plateclony-formingtestandadhesiontestwereperformedtoassesstheMKN-45cells‘proliferativeactivity,clony-formingcapabilityandadhesiveabilitybeforeandaftertransfection.ResultsFHITover-expressioncanreduceMKN-45cells‘proliferationandclony-formingcapability(),butitwasineffectivenessonMKN-45cellsandendothelialcellsadhesion.ConclusionFHITover-expressioncaninhibittheproliferationandclony-formingabilityofhumangastriccelllineMKN-45,itdosenotworkonMKN-45cellsandendothelialcellsadhesiveability.
Keywords:
FHIT;gastricneoplasms;cellproliferation;cloning,molecular;genes;transfection;celladhesion
胃癌的发生已被公认是一个多基因、多步骤过程,涉及ras、p27等癌基因,p53、APC等抑癌基因,但完整的胃癌发生基因谱仍不清楚。
脆性组氨酸三联体(fragilehistidinetriad,FHIT)基因是Ohta等于1996年从上皮癌细胞系区域克隆出的一个候选抑癌基因,该基因在所有检测过的人正常组织中都表达;但在多种肿瘤组织和细胞系中,FHIT基因结构及表达异常[1~3]。
我们将成功构建的含FHIT基因的真核表达载体转染至人胃癌细胞系MKN-45中,得到稳定的过表达,观察转染前后MKN-45细胞系增殖、克隆形成、细胞粘附等方面生物学行为的变化,以探讨FHIT基因对胃癌的影响。
1材料与方法
材料
细胞系和材料 人低分化胃腺癌细胞系MKN-45、人脐静脉内皮细胞系ECV304,由东南大学临床医学院中心实验室馈赠。
真核表达质粒购自Invitrogen公司。
主要试剂RPMI1640培养基购自美国Gibco公司,胎牛血清购自杭州四季青公司,脂质体Lipofectamin2000购自美国Invitrogen公司。
二甲基亚砜购自上海凌峰化学试剂有限公司,MTT购自Promega公司,其它生化试剂均为分析纯。
方法
细胞培养人低分化胃腺癌细胞系MKN-45、人脐静脉内皮细胞系ECV304,在37℃、5%CO2培养箱中培养,培养液为含10%小牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的RPMI1640。
真核表达质粒的转染参照说明书,用lipofectamine2000将真核表达质粒转染至FHIT基因mRNA阴性表达的人胃癌细胞系MKN-45。
转染后采用G418筛选阳性克隆,并且继续培养。
用RT-PCR法检测FHIT基因mRNA的表达。
转染组细胞有目的基因条带出现,而转染空质粒组和阴性对照组均无目的条带出现,证明转染成功。
MTT法检测细胞增殖活性分别收集空白对照组、转染组和转染组处于对数期的细胞,调整细胞悬液浓度,分于96孔板,1×104/孔。
置37℃,5%CO2培养箱培养使细胞贴壁。
根据不同组别,12、36、60、84h后检测细胞活性。
检测时小心吸去上清,PBS轻轻洗涤,再次弃上清。
每孔加入180μl新鲜RPMI1640培养液,再加入MTT溶液20μl,继续培养4h。
终止培养,小心吸去孔内培养液。
每孔加入150μl二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪490nm或570nm处测量各孔的吸光值。
同时设置调零孔,每组设定3复孔。
以OD值为纵坐标,以时间为横坐标,绘制生长曲线。
平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 分别收集空白对照组、转染组和转染组细胞接种在6孔板上,每孔为200个细胞,常规培养20天后姬姆萨染色。
冲洗染色液,观察各平皿细胞克隆的形成数量。
黏附实验检测细胞粘附能力变化 培养的人脐静脉内皮细胞系ECV304经PBS洗涤两次,接种于96孔板。
待内皮304细胞长满96孔板,弃去培养液,PBS洗涤一次。
将分别收集的空白对照组、转染组和转染组细胞5×104个/孔接种其上。
将96孔板放入37℃,5%CO2培养箱培养45min。
PBS洗涤两次,弃去未被吸附的内皮304细胞。
加入%RoseBergal,100μl/孔,室温放置5min,PBS洗涤两次。
加入95%乙醇,200μl/孔,室温30min,570nm测光密度值。
细胞吸光率=总吸光率-内皮细胞吸光率。
实验重复三遍。
统计学分析计量资料以±s表示,采用SPSS统计软件进行单因素方差分析均数间差别多重比较的LSD(Leastsignificantdifference)检验。
统计结果的图形化由Excel2000绘图程序完成。
2结果
重组质粒转染MKN-45细胞后FHIT基因mRNA的表达情况细胞有462bp大小的目的基因条带出现,而MKN-45细胞和MKN-45细胞均无目的条带出现。
FHIT基因过表达对MKN-45细胞增殖能力的影响 随着细胞培养时间的逐渐延长,转染组细胞的生长曲线增长幅度较空质粒转染组及空白对照组细胞降低。
细胞生长至84h,转染组细胞生长曲线明显低于空质粒转染组和空白对照组。
而空白对照组和空质粒转染组间差异无显着性。
见表1。
FHIT基因过表达对MKN-45细胞平板克隆形成能力的影响图3可见转染组细胞克隆形成能力低于空质粒转染组和空白对照组。
而空白对照组和空质粒转染组间差异无显着性。
FHIT基因过表达对MKN-45细胞与内皮细胞间粘附能力的影响各组之间吸光度值差异无显着性(),提示FHIT基因过表达对MKN-45细胞与内皮细胞间粘附能力无明显影响,见表2。
图1转染MKN细胞后RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图
转染组;空质粒转染组;3.阴性对照组;Ladder
表1FHIT基因过表达对MKN-45细胞增殖的影响
a:
。
转染组与空质粒转染组和空白对照组相比差异有显着性
图2FHIT基因过表达对MKN-45细胞增殖能力的影响
表2FHIT基因过表达对MKN-45细胞与内皮细胞粘附能力的影响
a.空白对照组;空质粒转染组;转染组
图3FHIT基因过表达对MKN-45细胞增殖能力的影响
3讨论
Guo等[4]认为FHIT基因与肿瘤细胞增殖及周期无关。
但PichiorriF等[5]认为FHIT可通过依赖caspase途径的凋亡而抑制细胞生长,YoshihitoN等[6]的研究认为,FHIT基因可通过抑制IκB-α的磷酸化进而阻断NF-κB信号通路而起到抑癌作用。
FHIT的激活可通过调控细胞P53凋亡因子的作用而影响肿瘤细胞增殖。
我们将转染至FHIT基因mRNA阴性表达的人胃癌细胞系MKN-45,使其FHIT基因过表达后,MKN-45细胞生长曲线增长幅度较空白对照组及空质粒转染组低。
实验结果提示FHIT基因过表达可使MKN-45细胞的增殖活性受到抑制,这表明FHIT基因的表达水平可影响到胃癌细胞的增殖活性,该基因可能参与癌细胞增殖的负性调控。
FHIT基因在体内和体外均有抑制MEC-1细胞增殖和成瘤性的功能,可降低细胞的分化程度[7]。
关于FHIT基因抑制肿瘤细胞增殖的机制,目前认为FHIT基因主要通过其产物FHIT蛋白参与Ap3A的代谢及AMP2酶介导的细胞信号形成,从而阻滞细胞增殖。
RenCC等[8]认为FHIT蛋白是一种典型的二腺苷三磷酸(Ap3A)水解酶,能区域特异性地水解ApnA(n=3-6)成为ADP和AMP。
FHIT蛋白水解酶活性丧失导致Ap3A水平升高,Ap3A是ATP的类似物,能抑制蛋白激酶的活性。
Ap3A水平升高则增强了生长信号转导途径,阻断抑制途径和凋亡途径,参与肿瘤的发生。
也有研究认为Ap3A是哺乳动物细胞中的一种第二信使,并可导致细胞周期的阻滞。
但WaliA等[9]认为FHIT蛋白的抑制肿瘤作用与Ap3A水解酶活性无关,而可能主要依赖FHIT蛋白与底物或其它相关接头分子的结合。
他们把突变型FHIT基因转染到FHIT缺陷的肿瘤细胞中,发现编码产物虽无Ap3A水解酶活性,却同样能抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤作用。
克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一。
通过计数克隆形成数,可了解细胞的增殖力和对生存环境的适应能力。
本实验结果提示:
FHIT基因过表达后,MKN-45细胞的平板克隆形成能力低于空质粒转染组和空白对照组,而空白对照组和空质粒转染组间差异无显着性。
这表明FHIT基因可能对胃癌细胞系的克隆形成能力有一定的影响。
肿瘤转移是一个多阶段的复杂过程,粘附是肿瘤侵袭和转移的始动因素。
粘附导致肿瘤细胞在脉管内聚集及穿出管壁向远隔组织转移。
肿瘤细胞与内皮细胞间的粘附是其穿出脉管的第一步,主要通过肿瘤细胞上的整合素与内皮细胞结合。
介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间相互粘附的为细胞粘附分子。
CAMs存在于细胞膜表面或ECM中的跨膜糖蛋白,它们通常以配体和受体相结合的方式而发挥作用。
其基本功能是介导细胞粘附,同时参与细胞的信号转导与活化、细胞的生长及分化、炎症、肿瘤转移等一系列重要生理和病理过程。
我们通过肿瘤细胞体外粘附实验模型,来检测FHIT基因的转染对人胃癌细胞系MKN-45细胞与内皮细胞粘附能力的影响,结果显示FHIT基因过表达对于MKN-45与内皮细胞的粘附能力没有明显的影响,FHIT基因可能通过别的途径影响肿瘤细胞的转移。
综上所述,我们将转染至FHIT基因阴性表达的MKN-45细胞使其过表达FHIT基因。
比较转染前后MKN-45细胞生物学行为的改变,结果显示FHIT基因的过表达使得MKN-45细胞的增殖和克隆形成能力受抑制,提示FHIT基因在胃癌的发生、发展中起着一定的作用,但具体机制尚需进一步研究。
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