细胞培养.docx

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细胞培养

细胞培养

一、实验室的设置

1.制备室：

主要进行培养液及有关培养用液体的制备。

2.清洗和灭菌室

3.储藏室：

该区的主要设备有冰箱、液氮罐、储物柜等。

4.无菌操作室：

相对密封、防尘、防菌的工作空间，一般划分为更衣间、缓冲间及操作间三部分。

5.培养与观察室：

应在干扰少而非来往穿行的区域。

二、常用仪器与设备

1.超净工作台

1）工作原理:

利用鼓风机驱动空气遁过高效微粒滤层除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。

净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌无尘环境。

2）按气流方向分为两种:

外流式（水平层流式）净化的气流朝操作者方向流动；侧流式（垂直式）气流从上向下或从左至右。

2.倒置显微镜

3.CO2培养箱

CO2培养箱设定的条件为37℃，

100%湿度，5％CO2。

应注意的问题：

①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。

②保持培养箱内空气干净。

定期消毒。

③箱内灭菌蒸馏水3000毫升以保持箱内湿度，避免培养液蒸发

4.冰箱

•培养液、缓冲液、消化液

•血清、酶、配制的抗生素谷氨酰胺溶液

5.真空泵

6.高压消毒锅

电热自控立式压力蒸汽消毒器

手提式压力蒸汽灭菌器

7.水纯化装置

8.离心机

9.液氮罐

功能:

冷冻保存细胞

结构:

液氮罐为双层结构，中间为真空层。

使用时应注意事项：

①液氮温度:

-196度,搬动和装入液氮,取放细胞时，防止冻伤。

②初次启用液氮罐时，应慢慢加入液氮。

10.水浴锅

11.电热干燥箱

•用于细胞培养中的有些器械、器皿烘干时使用，玻璃器皿也需干燥消毒。

一般选用的电热干燥箱的温度范围在50～300℃。

其优点是温度均匀，效果较好。

•缺点是升温较慢

使用注意:

消毒后不能立即打开箱门以免骤冷而致玻璃器皿损坏,应等温度自然下降,至100度以下时开门。

12.过滤除菌装置

13.酸缸

•用于盛放清洁液（重铬酸钾浓硫酸）

•先把重铬酸钾研碎--------加水，加热熔解--------冷却------在冷水浴中加入浓硫酸，边加边搅拌（棕红色）

•重铬酸钾：

浓硫酸：

蒸馏水=63:

1000:

200/120:

200:

1000/100：

100：

1000

配酸和浸酸时应注意事项

①应加强防护，最好戴口罩、防护衣、防护镜、耐酸手套等。

②配制、盛装清洁液的容器应防酸、耐热、有较大的开口，

③一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品。

④物品应完全被充满和覆盖。

⑤浸泡时间不能少于6小时

⑥若清洁液的颜色变暗、发绿或混浊时，应弃去，配制新的。

新的呈棕红色。

14.移液器

15.天平

16.培养器皿

17.手术器械

18.细胞记数板

细胞培养器皿器械的洗涤

意义：

细胞培养对条件的要求严格，容易受到不稳定条件的影响，所以在实验过程中所用到的器皿与器械的洗涤对细胞培养的成功也是致关重要的一步。

（一）玻璃器皿的清洗

要求:

干净透明无油迹，且无任何残留物质。

步骤：

浸泡、刷洗、泡酸、冲洗

清洗步骤

1.浸泡：

目的是软化和溶解附着物；新的用5%盐酸浸泡过夜

2.刷洗：

放在洗涤剂用软毛刷刷洗中反复刷洗，清水冲洗，晾干。

3.泡酸：

6小时或过夜

4.冲洗：

“注满水-倒空”20次以上或注入“2/3的水后振荡冲洗”20次以上→蒸馏水冲洗2～3次→三蒸水一次

（二）、塑料器皿的洗涤

浸泡→棉球擦洗→流水冲洗干净，晾干→2%NaOH浸泡过夜→流水冲洗干净→5%盐酸浸泡30分钟→流水冲洗充分→蒸馏水漂洗2-3次→双（三）蒸水冲洗1次→晾干或烘干

（三）、胶塞的清洗

浸泡→2%NaOH煮沸10-20分钟→冲洗→1%盐酸浸泡30分钟→蒸馏水漂洗2-3次→双（三）蒸水冲洗1次→晾干或烘干

（四）、滤器的清洗

用清洗液刷洗新的或使用后的滤器

流水冲洗15分钟或浸泡过夜→蒸馏水浸泡24小时→双（三）蒸水浸泡24小时→晾干或烘干

（五）、金属器械的清洗

自来水擦洗→蒸馏水漂洗2-3次→双（三）蒸水冲洗1次→晾干或烘干

实验室与器械器皿的消毒

意义：

细胞培养要在无菌条件下进行，所以实验室以及所用器皿与器械的无菌是必须要做到的，不同的器械器皿有不同的消毒方式。

一、实验室的消毒

1、超净工作台：

1‰新洁尔灭→75%酒精棉球擦台面→紫外灯照射30分钟

2、CO2培养箱：

1‰新洁尔灭→75%酒精棉球擦洗→晾干→90℃14h→紫外灯照射60分钟

3、电热干燥箱：

1‰新洁尔灭→75%酒精棉球擦洗→晾干→90℃1h

4、冰箱：

75%酒精棉球擦洗→晾干

5、显微镜：

75%酒精棉球擦洗→晾干

6、仪器表面与实验室的地面、灯具、墙面、门窗：

1‰新洁尔灭→甲醛熏蒸24h（5-7.5g高锰酸钾+10-15ml40%甲醛）→紫外灯照射6h

二、器械与器皿的消毒

主要分为物理法和化学法两类

物理法：

干热、湿热、滤过、紫外线及射线等，

化学法指使用化学消毒剂等。

1、紫外线消毒

作用机制：

破坏微生物的核酸和蛋白质，产生的O3杀死微生物

作用对象：

空气、操作台表面、不能使用其他方法进行消毒的器皿

注意事项：

对试剂及培养液、皮肤、眼睛有害

2、湿热消毒

作用机制：

101kPa（121.3℃）高压灭菌15~20min或65kPa（115℃）高压灭菌10min，高温杀死微生物

作用对象：

玻璃制品、不怕高温的溶液、金属器械、布类、部分塑料制品

注意事项：

液体不要装的过满，保证容器内气体流通，正确使用高压灭菌锅，不同物品其有效灭菌压力和时间不同

3、干热消毒

作用机制：

180℃45~60min或160℃90~120min高温杀死微生物

作用对象：

玻璃器皿

注意事项：

等温度下降后方可打开

4、灼烧

作用对象：

金属、玻璃制品的口缘

注意事项：

部分器皿若用酒精擦过，要晾干才可灼烧

5、过滤消毒

作用机制：

孔径为0.22μm或0.45μm微孔滤膜可除去细菌和霉菌等

作用对象：

气体、含有不耐热成分的培养基和试剂

注意事项：

虑膜的安装，无侧漏

6、化学消毒

作用机制：

化学物质杀死微生物

常用的有：

2%煤酚皂溶液（来苏尔）、0.25%新洁尔灭、1%升汞、3~5%甲醛溶液、75%酒精。

作用对象：

空气、台面、操作者皮肤、地面、墙壁、器械等

注意事项：

一些消毒液对人体有害

三、抗生素消毒

主要用于培养用液的灭菌或预防培养物污染

常用：

青霉素、链霉素、四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、两性霉素B等

小镊子、大镊子、小解剖剪、帽子、口罩、50ml离心管、1.5ml离心管、吸管、玻璃培养皿、培养瓶、青霉素小瓶、塑料培养皿、鞋套、乳鼠、鸡蛋、容量瓶、移液管、量筒、小烧杯、滤器、0.22μm滤膜、血清瓶、铝饭盒、托盘、注射器、吸耳球、培养液、PBS、胰蛋白酶溶液、PS、谷氨酰胺溶液

原代培养

一、取材：

从理论上讲，各种动物和人体内的所有组织都可进行培养。

实际上幼体组织尤其是胚胎组织比年老个体的组织容易培养；分化程度低的组织比分化程度高的容易生长；肿瘤组织比正常组织容易培养。

取材之后，最好立即培养，如因故不能培养时，应把组织切成1cm3左右的小块，置于培养液中，4℃贮存；存放时间不宜超过24h，放置时间过长或组织块太大，细胞仍易坏死。

1、取鸡胚组织

2、取鼠胚组织

3、取皮肤

⏹可在上臂和大腿内侧等处，先用肥皂洗净取材部位皮肤，用75%酒精擦拭消毒2—3次。

⏹用注射器针尖轻轻斜刺入表皮内2毫米左右，向上挑起一个小皮丘，然后用手术刀紧贴针尖下方，切下直径2—3毫米小片，深度以创面微见血迹为度。

⏹用拇指和食指把取皮部皮肤紧捏部，在绷起的皮肤表面，用手术刀轻轻片取一小片表皮，大小和深度同前。

这样取材难免带一些真皮组织，必要时亦可用外科刮皮刀刮取。

4、取体液

⏹取血部位：

静脉取血法，耳垂或指尖取血。

⏹肝素常用浓度为20μg/ml，抽血前先用500μg肝素/ml（生理盐水配制）湿润针管后推出的方法亦可。

⏹骨髓组织、羊水、胸水和腹水

5、取胚胎干细胞

取小鼠3.5d胚龄的囊胚，培养在13.5d小鼠胚胎制备的胚胎成纤维细胞饲养层上，

将可能抑制ES细胞培养的滋养外胚层去除，内层细胞团移植到小鼠胚胎来源的成纤维细胞饲细胞层上，经过短暂的粘附和展开的过程，将细胞重新分散并转移到另外的饲细胞层

二、组织细胞的分离

⏹机械法

离心分离法

切割分离法

机械分散法

⏹消化法

胰蛋白酶消化法

胶原酶消化法

螯合剂消化法

⏹1、⑴　脐带收集：

用无菌止血钳夹闭脐带两端，在止血钳外侧剪断脐带，放入盛有4℃CordBuffer的饭盒内。

脐带在4℃放置不应超过24小时。

⑵脐带内皮细胞分离

　　带无菌手套，取出脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，用无菌剪刀将两端脐带剪除。

　　　　　　　　　　　　　↓

在脐带一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用2根粗丝线扎牢，用CordBuffer抽吸有的30ml注射器冲洗静脉腔，至将脐血洗净。

　　　　　　　　　　　　↓

　　赶出静脉腔内残余液体，将脐带另一端用止血钳夹闭，用10ml注射器连接针头，注入37℃预热的0.1％胶原酶约6-8ml，放入37℃CordBuffer中保温6-10min

　　　　　　　　　　　　　↓

　　吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20mlcordBuffer的离心管中，冲洗静脉腔，一并加入离心管中。

　　　　　　　　　　　　　↓

离心，1500rpm,10min弃上清，用5～7ml20％FCS，RPMT1640重悬细胞，转入培养瓶，放5％CO2孵箱

2、离心分离法

血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液：

500-1000rpm低转速离心5-10min。

分层液是根据细胞比重不同，使各类细胞相互分开的。

红细胞比重1.092，淋巴细胞和大单核等白细胞比重为1.070；分层液适用于分离血中淋巴细胞。

3、切割分离法

剪刀剪切法可能对组织有一定损伤，但操作比较方便。

另外，亦可用手术刀反复切割法，把组织块放在凹窝玻璃中，两手各持尖手术刀一把，交错反复切害割至1mm3为止。

手术刀切割法对组织损伤较小，但在空气中暴露时间较长，污染机会大些。

以上两方法都适用于组织块培养法。

4、机械分散法

机械纱网压挤滤过法简便易行，节省时间，但对组织可能有一定损伤。

纱网网眼愈小，所需压力越大，组织受损越重，故本法仅适用于处理软组织，如脑、胚胎以及一些肿瘤组织等；对较硬组织和纤维性组织效果不好。

5、胰蛋白酶法

使用最广泛。

适宜消化间质少的软组织如肝肾等，对硬癌组织效果差。

所需时间较短，主要缺点是破损细胞。

6、胶原酶解离细胞法

对解离纤维性、分离上皮、胚胎性、正常和恶性组织是很有效的。

此酶消化作用缓和，且无须机械振荡，胶原酶最终浓200ug/ml，36.5℃温育，一般温育4-48h。

胶原酶和透明质酸酶协同作用有助于分离大鼠或兔的肝脏组织，透明质酸酶对细胞表面糖基有作用。

价格较高，大量使用增加成本。

7、螯合剂消化法

较胰蛋白酶作用缓和，很少用于单独消化新鲜组织（传代细胞可单用），如与胰蛋白酶按不同比例相混合并用，消化作用更好。

EDTA（0.02%）最适消化传代细胞，也多与胰蛋白酶（0.25%）混合使用（1：

1或2：

1）。

原代细胞培养（乳鼠）

实验目的

⏹掌握原代细胞培养的一般方法和步骤

⏹掌握培养过程中无菌操作技术

⏹熟悉原代培养细胞的观察方法

实验材料

  CO2培养箱、培养瓶、倒置相差显微镜、青霉素小瓶、玻璃瓶皿、手术器械、吸管、离心机、水浴锅（37℃）、离心管、100ml小烧杯等75%酒精、PBS、DMEM-10、0.25%胰蛋白酶、3周龄乳鼠

实验内容

1、提前30min将吸管、玻璃培养皿摆放在超净台上，打开风机及台面紫外灯。

2、将乳鼠引颈处死，75%酒精2-3s，拿入操作间放入超净台中玻璃培养皿中，解剖取出肝脏于另一盛有PBS的玻璃培养皿中洗3次。

3、在青霉素小瓶中，剪碎（1mm3），PBS洗3次。

4、加入约2ml0.25%胰蛋白酶，移入2ml的离心管，封口膜封口（用酒精擦过），37℃水浴消化20-40min，每隔5min振荡一次。

5、组织发毛、发白时，1000rpm离心2-3min，弃上清。

6、加入2mlDMEM-10终止反应，吹打，1000rpm离心2-3min，弃上清。

7、加入2mlPBS，吹散细胞，再离心一次，弃上清。

8、加入1mlDMEM-10，移入培养瓶，补足5ml，37℃，CO2培养箱培养

注意事项

1、不得说话，咳嗽。

操作之前之后都用75%酒精棉球擦台面。

2、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件下。

3、操作前，75%酒精喷手，棉球擦拭试剂瓶，晾干，不得过早的打开试剂瓶、培养瓶。

瓶口打开或盖上时，瓶口和盖子都要过火，瓶盖向上放在手碰不到的地方，手不要碰瓶盖的工作部分。

4、不能用手触及消毒器皿的工作部分，操作在酒精灯附近进行，耐热物品经常过火，金属器械灼烧时间不得太长，冷却后放可夹取组织，吸取过营养液的用具不得再灼烧。

5、操作时避免两手交叉，手在开口的容器上晃动

6、吸溶液的吸管等不能混用，吸溶液或滴溶液不要碰到容器口，最好滴时悬空滴入。

避免直接瓶口对瓶口的倒液体。

7、手不得随便拿出超净台，用完的器皿放入清水中泡上。

8、培养瓶放入CO2培养箱前应拧松瓶盖，拿出时应拧紧瓶盖。

细胞的传代

一、实验目的

掌握无菌操作技术。

掌握传代细胞的培养的一般方法与步骤。

掌握培养细胞的消化方法。

了解在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。

二、实验材料及设备

1、细胞：

人结肠癌HT-29细胞

2、试剂：

胰酶、1640培养基、血清、抗生素

3、仪器：

超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜

4.其它用品：

培养瓶，吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯

三、实验步骤

1.准备：

超净工作台紫外线处理30分钟,用肥皂洗手,穿鞋套，用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。

2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。

将培养用液置室温下预热。

3．关闭超净台紫外灯,打开可见光灯开关,打开抽风机清洁空气，除去臭氧。

用75%酒精擦双手消毒。

4.正确摆放超净台内的实验用品：

酒精灯、酒精棉球、试管架、吸管、废液缸等。

准备好实验试剂：

1640培养基（其中血清含量10%）、血清、胰酶、PBS等。

5.点燃酒精灯；将培养用液（90mL）瓶口用75%酒精消毒,打开血清瓶，瓶口过酒精灯;无菌吸取10mL血清加入到培养液（90mL）中，加入双抗轻轻混匀，配置完全培养基。

6.细胞瓶口靠近火焰打开瓶盖并在酒精灯上烧口消毒，倒掉或吸出培养基（对于小口的培养瓶可采用倾倒方法,对于培养皿,必须用吸管吸出）

7.加PBS轻轻漂洗一下细胞，弃PBS，再加入适量胰酶（以盖住细胞量为准），转动培养瓶，使其湿润整个细胞层，盖好瓶盖。

8.显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收缩、突起、一半变圆，细胞边界清晰时，即可立起或翻转培养瓶停止消化，在超净台内靠近火焰处加培养基终止消化。

9.全面吹打细胞瓶壁,吹打均匀，分装3-4瓶，补足培养基，做好记录，倒置相差显微镜下观察细胞的形态，放入CO2培养箱培养。

四、注意事项

把握好传代时机（指数增长期），过早细胞量少，过晚细胞健康状态不佳

消化时间要适度，过短细胞不易脱落，过长细胞可脱落流失。

消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失。

不同细胞对消化反应不同。

贴壁不牢—直接吹下—细胞损伤

细胞的冻存、复苏与运输

1、细胞的冻存：

是细胞室的常规工作。

细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。

⑴原理：

在低于-70C的超低温条件下，细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。

⑵原则：

缓慢冻存

v当细胞冷到零度以下：

细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。

v如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。

复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

⑶慢冻程序

v标准程序：

当温度在-25℃以上时，1～2℃/min

当温度达-25℃以下时，5～10℃/min

当温度达-100℃时可迅速放入液氮中细胞冻存器

v简易程序：

将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。

⑷低温保护剂的应用

渗透性：

具有渗透性的冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子的物质，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、甲醇等。

常用的是DMSO，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

非渗透性：

非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羟乙基淀粉等。

⑸冷冻保存温度

冷冻保存温度是指能长久保存细胞的一个深低温度。

在这样的温度下，细胞生化反应极其缓慢或停止，但经长期保存和复苏后仍能保持正常的结构和功能。

从实际和效益的观点出发，液氮温（﹣196℃）是目前最佳冷冻保存温度。

实验具体操作：

⏹取生长状态良好的细胞去除培养液，加入胰酶消化，消化好后，加入培养基吹打数次，离心，弃上清液。

⏹加1.5mL冻存液吹打均匀。

⏹将细胞悬液吸至冻存管中，拧好盖，封口，并标记好细胞种类，冻存时间，保存条件以及冻存者姓名等。

⏹冻存管在4度以下存放30min，转放到-20度1.5－2h，再转到-70度4－12h后即可转移到液氮内，注意做好冻存记录。

⒉细胞复苏方法

原则：

快速复苏

（l）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。

回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。

（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。

（3）低速离心10分钟。

（4）去上清，加新鲜培养液培养复苏的细胞

3.培养细胞的运输

v冷冻储存运输：

利用特殊容器盛液氮或干冰保存。

效果好但麻烦。

v贴身运输法：

选生长状态好的细胞，生长1/3－1/2瓶底壁，弃掉旧培养液，补充新培养液至瓶颈留微量空气，封口膜封口。

贴身携带，达目的地后倒掉多余培养液，次日换液

总结

细胞培养整个过程最重要的市无菌操作。

无菌室的灭菌：

1、定期打扫无菌室：

每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。

2、CO2孵箱（培养箱）灭菌：

先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射

3、实验前灭菌：

打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟

4、实验后灭菌：

用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。

实验人员的无菌准备：

1、肥皂洗手。

2、穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋

3、用75％酒精棉球擦净双手。

无菌操作的演示：

1、凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面

2、靠近酒精灯火焰操作。

3、器皿使用前必须过火灭菌

4、继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。

5、各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。

如吸管不能碰到废液缸。

6、吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。

器械的清洗和消毒

玻璃器械洗消：

一、新的玻璃器皿的洗消：

1、自来水刷洗，除去灰尘。

2、烘干、泡盐酸：

烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。

3、刷洗、烘干：

12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。

4、泡酸、清洗：

用清洁液（重铬酸钾120g：

浓硫酸200ml：

蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。

5、烘干、包装：

洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。

6、高压消毒：

包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。

7、高压消毒后烘干

二、旧的玻璃器皿的洗消：

1、刷洗、烘干：

使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。

2、泡酸、清洗：

烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。

3、烘干、包装：

洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。

4、高压消毒：

包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。

（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）

5、烘干备用：

因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。

金属器械洗消：

金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。

放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。

橡胶和塑料：

橡胶和制品通常处理方法是：

先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：

1、针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上（凹向上），然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。

注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。

2、胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。

然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。

最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。

3、胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。

然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。

最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。

4、胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。

5、塑料培养瓶，培养板，冻存管：

6、其他消毒方法：

有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。

塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。

也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。

用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。

为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。

其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时__这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判