并购重组重组蛋白和多肽的分离纯化.docx

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并购重组重组蛋白和多肽的分离纯化

重组蛋白和多肽的分离纯化

1.      概述

分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstreamprocessing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。

目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。

选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。

表1重组蛋白不同表达策略的优点和缺点

表达策略

优点

缺点

分泌表达至细胞外

增强正确二硫键的形成

降低蛋白酶对表达蛋白的降解

可获得确定的N末端

显著减少杂蛋白水平，简化纯化

不需要细胞破碎

表达水平低

多数蛋白不能进行分泌表达

表达蛋白需要进行浓缩

细胞周质空间表达

增强正确二硫键的形成

可获得确定的N末端

显著减少杂蛋白水平，简化纯化

好些蛋白不能分泌进入周质空间

没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术

周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解

胞内包涵体表达

包涵体易于分离

保护蛋白质不被降解

蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的影响，通常可获得高的表达水平

需要体外的折叠和溶解，得率较低

具有不确定N末端

胞内可溶性蛋白表达

不需要体外溶解和折叠

一般具有正确的结构和功能

高水平的表达常难以得到

需要复杂的纯化

可发生蛋白质的酶解

具有不确定的N末端

在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。

在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。

所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。

当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。

蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。

除了在分离纯化的初期，要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质，还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素，来避免蛋白质失去活性。

蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）和去折叠（u）间自由能的变化（ΔGf→u）来衡量，ΔGf→u越大蛋白质就越稳定。

根据报导蛋白质的ΔGf→u在5—20kcal/mol范围之间，单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化，一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化，因此ΔGf→u相对比较小，这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点，所以必须克服蛋白质内在的不稳定性，保留蛋白的活性。

这一点在分离纯化和蛋白质储存中都很重要，影响蛋白质稳定性的因素有温度、pH、离子强度、某些添加剂、表面吸附、震摇、剪切力、冻融、蛋白浓度、压力等，这些因素对折叠的影响有的是可逆的，有的是不可逆的，而且相互之间也有影响，在实际处理中应选择合适的条件，尽量避免不利因素的影响

（2），并利用活性跟踪的方法对处理进行评价，指导分离纯化。

在进行任何纯化工作时，第一步必须针对目标蛋白建立特异性的分析方法。

这些特异性的分析方法都是基于目标蛋白的一些特性，如酶的活性，免疫学活性，物理特性（如分子量、等电点、光谱学特征等），生物学活性。

在理想的情况下，我们希望所选择的分析方法具有特异、快速、灵敏和可定量的特点。

特异性要求分析方法反映目标蛋白的独特性，以排除假阳性。

快速则要求能很快的给出定性和定量结果，以便更好的与分离纯化的工作相衔接。

灵敏的分析方法仅需要少量的样品，这就给操作带来了极大的方便。

在分离纯化的每一步，都需要对蛋白和活性进行定量，这就要求分析方法有准确可定量的特点，以对分离纯化的效果进行评价。

如通过SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量来鉴定蛋白质，由于电泳的分辨率限制，常常不能确定收集部位中是否含有目标蛋白或目标蛋白是否得到了富集，这时就需要运用更特异的分析方法，如Westernblotting就可以从复杂的混合物中描述蛋白的分子量，并对蛋白进行定量。

另外当一些蛋白没有方便可用的生物学活性测定方法，或者由于干扰物质的存在不能测活，可应用一些免疫学的方法进行检测。

在纯化的过程中，需要监测以下几个参数：

总的样品体积，样品中总的蛋白，目标蛋白的活性单位，通过这些基本的信息，就可以跟踪每步纯化的效率，计算出目标蛋白的回收率，目标蛋白的比活性，以及纯化的倍数，从而对纯化的每一步，乃至整个流程进行定量评价。

Richard等在纯化重组大肠杆菌RNA聚合酶σ32亚基的工作中给出了很好的范例，在定量测定项中，包括了蛋白质的定量测定、定量SDS-PAGE、定量蛋白质斑点印迹和酶活测定，使用这些方法对操作的每一个阶段取样进行纯化效果的评价，从而确保每一步纯化的有效性

（1）。

正是由于分析方法在分离纯化中的指导性作用，所以有效的分析方法是分离纯化是否能够成功的前提。

1.      分离纯化的方法策略及其应用

下游的分离纯化步骤不仅要在可替换的分离技术间进行选择，如细胞的破碎可选择高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎或酶溶法，分离细胞、细胞碎片、包涵体和沉淀物，可选择离心或过滤，需要进行浓缩的时候，可选择沉淀或超滤；另一方面，设计的纯化工艺包括特定的层析步骤，及层析的先后顺序，以期得到最大的得率。

吸附层析，如离子交换层析，疏水层析和亲和层析，可基于特定的选择性达到对目标蛋白的纯化，适用于大量样品的处理。

凝胶过滤层析用于后续的精制步骤，如去除少量的杂蛋白或聚合体，在纯化过程中用于脱盐和缓冲液交换。

在分离纯化中对每个步骤的选择，可以遵循以下原则：

1应尽可能的利用蛋白质的不同物理特性选择所用的分离纯化技术，而不是利用相同的技术进行多次纯化；2不同的蛋白质在性质上有很大的不同，这是能从复杂的混合物中纯化出目标蛋白的依据，每一步纯化步骤应当充分利用目标蛋白和杂质成分物理性质的差异。

所以在分离纯化的开始阶段，要尽可能的了解目标蛋白的特性，不仅如此还要了解所存在杂质成分的性质，如大肠杆菌的蛋白大多是一些低分子量的蛋白（<50000Da），而且酸性蛋白较多；3在纯化的早期阶段要尽量减少处理的体积，方便后续的纯化；4在纯化的后期阶段，再使用造价高的纯化方法，这是因为处理的量和杂质的量都已减少，有利于昂贵纯化材料的重复使用，减少再生的复杂性（84）。

在下游的纯化工艺中为了提高蛋白的得率和处理的效率，应当使用最少的纯化步骤，经典的纯化过程如图1所示。

在初始的纯化阶段，除了使目标蛋白和细胞内的DNA、RNA、多糖以及性质差别较大的蛋白质成分分离，采用的分离方法要能除去影响目标蛋白稳定性的杂质，保护目标蛋白不被蛋白酶降解，进行目标蛋白的捕获和浓缩。

在这一阶段的纯化中，盐析沉淀仍然应用，但共沉淀的杂质常常很多，离子交换层析和疏水层析具有操作上的优点，可以再生使用，成为这一步通常选用的层析方法；中间阶段纯化是最为关键的阶段，这时要能达到和大量的杂蛋白分离，利用蛋白质不同的性质选择不同的纯化方法，每一步的方法要有足够的选择性，提高目标蛋白质的纯度；最后进行精制纯化，常用凝胶层析，使目标蛋白的纯度进一步提高达到要求。

对于包涵体蛋白质，由于涉及包涵体蛋白质的变复性，其纯化步骤和方法与可溶性蛋白不同，需要对每一种包涵体蛋白质建立相应的复性方法，将在后面作介绍。

图1经典的蛋白质纯化流程图

在工业上，为了尽可能提高过程的通量和减少生产的成本，发展的方法与传统的方法不同。

双水相萃取和扩张床吸附技术，可以处理全细胞培养液，通过整合技术的使用，能达到萃取、浓缩和初步纯化的目的。

另外这两种技术和亲和相互作用结合可进一步提高处理的选择性。

相似的，亲和相互作用还可以整合进其它的高通量处理，如亲和膜过滤和亲和沉淀

（2）。

生产上使用的非线性色谱，如置换色谱，一次层析的载量很大，得到的蛋白纯度很高，近年来也有很大的发展和应用（85,36）。

2.1包涵体蛋白质的折叠复性

在过去几十年的发展过程中，重组DNA技术为大规模生产目标蛋白提供了新的途径，尽管有不同的宿主系统可供选择，如果翻译后修饰不是蛋白质功能所必需的话，大肠杆菌和其它的原核宿主系统仍然是生产重组蛋白的首选（17）。

细菌如大肠杆菌可以在短时间里得到高水平表达的蛋白质，但同时表达的蛋白质常常形成非活性的包涵体。

包涵体的形成是一个由许多蛋白质参与的极端复杂的动力学过程，依赖于蛋白质的折叠速率和聚集速率，并且与蛋白质的合成和降解程度相关（35）。

强的表达系统，高的诱导剂浓度，相对较高的培养温度常常造成包涵体的形成。

除了外界因素，包涵体的形成依赖于蛋白质特异的折叠行为，而不是蛋白的通常特性，如大小，融合标签，相对的疏水性。

尽管如此，限制折叠速率的结构特性，如二硫键的形成常常是含有二硫键蛋白质正确折叠的限速步骤（并不绝对，因为有些蛋白质二硫键的破坏并不影响其功能），富含二硫键的蛋白质具有更为复杂的结构，当高水平表达时，由于大肠杆菌细胞质是一个偏还原性的环境，蛋白质容易形成错配的二硫键，这常常是包涵体形成的主要原因。

膜蛋白具有暴露的疏水区，表达时易于聚集形成包涵体，也有可能由于降解或对细胞的毒性作用使得表达水平极低（45）。

蛋白质的糖基化可以影响到蛋白质的折叠行为和溶解性，当它们在原核系统进行表达时，也容易聚集（4）。

蛋白质进行可溶性表达和表达形成包涵体各有利弊，对许多蛋白，再折叠很困难，或者不可能，进行可溶性的表达就是首选。

现在发展了许多方法减少包涵体的形成，如使用中等强度或弱的启动子，低温培养，有限的诱导，优化培养基条件，进行融合表达（49），与伴侣分子和折叠酶共表达（3,5），表达定位于不同的空间（7,58），选择突变的菌株（6,43）或其他的原核表达系统（34）。

由于影响蛋白质细胞合成和折叠的因素太多，优化结果不可预测，如对于抗体Fab片段，尽管只有可变区序列不同，也不能预测新的Fab片段在体内是否可以正确折叠（4），所以即使采用了促进可溶性表达的方法，也不能保证不形成包涵体。

从另一方面来讲形成的包涵体易于和细胞的其它成分分离，而且过量表达的目标蛋白在包涵体中得到了富集，提高了纯度，降低了分离纯化的难度。

所以如果包涵体蛋白可以进行体外的正确折叠，那么形成包涵体就可以接受，对易受细菌蛋白酶降解的蛋白质或对细菌有毒性的蛋白质来说，表达产生包涵体是绝对必要的。

内皮抑素（endostatin）可以特异性的抑制内皮细胞的增殖，具有抑制新生血管生成和抑制肿瘤生长的作用，已进入临床研究阶段。

采用酵母表达系统，可直接产生具有活性的蛋白质，但是表达的水平和蛋白质的回收率较低，采用大肠杆菌表达则形成包涵体，包涵体蛋白质的折