七氟醚迟发性预处理对大鼠局灶性脑缺血损伤后NFκB表达的影响.docx
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七氟醚迟发性预处理对大鼠局灶性脑缺血损伤后NFκB表达的影响
七氟醚迟发性预处理对大鼠局灶性脑缺血损伤后NF-κB表达的影响
叶治郭曲练王锷
（中南大学湘雅医院麻醉科，长沙410078）
[摘要]目的:
比较不同浓度七氟醚诱导的迟发性脑保护效应以及对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后不同时点NF-κB蛋白表达的影响。
方法:
健康SD雄性大鼠60只，体重220～300g，随机分为3组：
缺血再灌注组（IR组），2.5%七氟醚组（Sevo1组），4.0%七氟醚组（Sevo2组）。
采用大鼠大脑中动脉闭塞（middlecerebralarteryocclusion,MCAO）制备局灶性脑缺血再灌注模型，3组分别于脑缺血前24h吸入纯氧及2.5%或4.0%七氟醚+氧气混合气体60min。
缺血2h，再灌注24，72h后取脑组织，运用TTC染色测算脑梗死体积百分比，免疫组化染色检测NF-κB蛋白表达，从而分析七氟醚的脑保护效应。
结果:
与IR组相比，Sevo1组和Sevo2组再灌注24，72h脑梗死体积显著减少（P<0.05）；IR组脑组织顶叶皮层缺血半影区NF-κB表达明显增加，七氟醚能显著抑制脑缺血再灌注后24，72h缺血半影区NF-κB表达的增加（P<0.05）结论:
七氟醚对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有迟发性保护作用，其机制可能与降低NF-κB蛋白表达有关。
[关键词]七氟醚；迟发性脑保护作用；局灶性脑缺血再灌注损伤；NF-κB；
ThedelayedneuroprotectiveeffectofsevofluraneonexpressionofNF-κBfollowingtransientfocalischemia-reperfusioninrats.
YEZhi,GUOQu-lian,WANGE,
（DepartmentofAnesthesia,XiangyaHospital,Changsha,410078,China）
Abstract：
ObjectiveToinvestigatethedelayedneuroprotectiveeffectofsevofluraneonexpressionofNF-κBinratmodelsoftransientfocalischemia-reperfusion.MethodsAdultmaleSprague-Dawleyrats（220～300g）wererandomlyassignedintothreegroups:
Ischemia-reperfusion（I/R）,2.5%Sevoflurane（Sevo1）,4.0%Sevoflurane（Sevo2）groups,andsubjectedtorightmiddlecerebralarteryocclusion（MCAO）fortwohours.Sevofluranepreconditioningwasinduced24hbeforebrainischemiabyexposingtheanimalsto2.5%or4.0%sevoflurane+oxygenfor60min.TheanimalsintheIRgroupwereexposedto100%oxygen60minat24hbeforeMCAO.WeanalyzedtheeffeetsofsevofluraneonbrainbyevaluatingtheinfarctvolumeandtheexpressionsofNF-κBthroughTTCstainingandimmunohistochemistryat24and72hafterreperfusion,respectively.ResultsSevofluranecouldobviouslyreducedthebraindamageafterischemia-reperfusion，andtheinfarctvolumesweresignificantlyreducedintheSevo1andSevo2group，comparedwiththeIRgroup.TheexpressionsofNF-κBinischemicterritoryincreasedaftercerebralisehemia,sevofluranecoulddecreasetheexpressionsofNF-κB,remarkably24and72hafterreperfusion.ConclusionSevofluraneinhibitstheexpressionsofNF-κBduringfocalischemia-reperfusion，whichmaybeoneofthemechanismsofitsdelayedneuroprotectivefunction.
Keyword：
sevoflurane;delayedneuroprotection;cerebralfocalischemic-reperfusion;NF-kappaB;
缺血预处理（ischemicpreconditioning,IPC）对脑缺血再灌注损伤具有强大的保护作用，且表现出双时相效应：
即时效应（早期或经典性）（Acuteneuroprotection），这种保护作用立即发生，并大约持续2h；迟发性阶段（晚期或第二窗口保护作用），（delayedneuroprotection），经24h后再次出现，并持续72h[1]。
研究表明吸入麻醉药可以模拟缺血预处理，以减轻脑缺血再灌注损伤，其作用也具有双时相性[2-3]。
七氟醚（sevoflurane）是近年开始进入临床应用的吸入麻醉药，因其苏醒快、刺激小，既能增加脑血流量，又能保留中枢自主调节的特性，被广泛应用于神经外科手术。
近年来人们日益关注其在神经保护方面的作用。
但七氟醚预处理是否具有迟发性脑保护效应尚未有报道。
本实验在制备局灶性脑缺血再灌注模型前24小时，吸入浓度2.5%或4.0%七氟醚+氧气60min。
并应用免疫组化方法检测大鼠脑缺血再灌注不同时间窗NF-κB蛋白表达，以探讨七氟醚迟发性脑保护作用的机制。
1.材料与方法
1.1.材料
1.1.1主要实剂和仪器
七氟醚为美国Baxter产品，2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride（TTC）美国Sigma产品，NF-κBp65多克隆Ⅰ抗由SantaCruz公司提供，SP法免疫组化试剂盒和3’3’-二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，七氟醚挥发罐DrägerVapor2000为德国制造，Datex-Ohmeda气体监测仪为芬兰Ohmeda公司产品。
1.1.2实验动物及分组:
健康SD雄性大鼠60只，体重220～300g，随机分为3组：
缺血损伤组（IR组），2.5%七氟醚组（Sevo1组），4.0%七氟醚组（Sevo2组）。
各组根据不同时间点又分为再灌注24、72h组两个亚组，每亚组各10只大鼠。
1.2方法
1.2.1七氟醚预处理
参照文献[4]选用七氟醚预处理模型。
本实验选用雄性成年SD大鼠（220～300g），在制备局灶性脑缺血再灌注模型前24h，将实验大鼠置于一半密闭有机玻璃盒内，大小约30cm×30cm×20cm，设有进出气孔各一，通过麻醉气体挥发罐（DrägerVapor2000德国）持续输入含有2.5％或4.0%七氟醚的O2（4L/min），出气口连接麻醉气体分析仪测量盒内七氟醚、O2及CO2的浓度（Datex-Ohmeda气体监测仪，美国）。
灯泡加热，维持箱内温度为35～37℃，避免在麻醉过程中大鼠体温下降。
箱底铺满钠石灰，使CO2分压小于0.05标准大气压。
大鼠保留自主呼吸。
1.2.2七氟醚局灶性缺血再灌注模型的建立
七氟醚预处理24h后，参照文献[5]采用大鼠右侧大脑中动脉阻闭（middlecerebralarteryocclusion,MCAO）模型，动物术前禁食12h，自由饮水。
动物用10%水合氯醛（300～350mg/kg）麻醉后取颈部正中切口，分离右侧颈总动脉、颈外动脉，结扎颈外动脉分支，于近心端结扎颈总动脉，血管夹夹闭颈总动脉远端，在颈总动脉分叉处剪一小口，栓线采用直径0.30±0.02mm、长50mm的尼龙鱼线（4-0，ETHILON，Japan）置入，直至有轻微阻力为止，一般置入18~20mm。
缺血2h后，拔出线栓恢复灌注。
术中保留自主呼吸，体温由直肠温探头连接多功能监测仪监测，并用烤灯维持在37℃~38℃。
1.2.3脑梗死灶百分比的测定：
神经行为学评分完成后，以10％水合氯醛深麻醉大鼠后迅速断头取脑，脑组织取出后置于-20℃低温冰箱快速冷冻30min，去除嗅球、小脑和低位脑干，由前向后冠状面切片，片厚2.0mm，置于2.0％2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）（Sigma产品，美国）溶液中，在37℃水浴箱中避光孵育20min，显色完全后置于4％多聚甲醛溶液固定。
线粒体过氧化氢酶可氧化TTC，使存活组织呈深红色，坏死组织不着色呈苍白色。
固定24h后用数码相机（SONY日本）将染色后切片照相，输入计算机，用图像处理软件（PhotoshopCS）测量脑梗死面积，根据公式V=t（A1+…+A5）计算脑梗死体积，其中t为脑片厚度，A为梗死面积，脑梗死灶总体积与全脑体积之比为梗死容积百分比。
1.2.4NF-κB免疫组织化学检测:
各组大鼠分别于再灌注24和72h再次麻醉，4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS）0.01mol/L，pH7.4灌注液心脏灌注固定后，取脑，以视交叉和其后4mm处两点冠状切片，片厚4mm，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切成4μm厚的连续冠状石蜡切片
（1）石蜡切片常规脱蜡至蒸馏水。
（2）0.0lmol/LPBS（pH7.40）洗涤（5min/次×3次，下同）。
（3）3%过氧化氢液室温下孵育20min（消除内源性过氧化物酶）。
（4）蒸馏水洗，PBS缓冲液浸泡5min。
（5）切片经抗原微波修复15min，其中NF-κBp65修复液为1.0mmol/LEDTA（pH8.0）。
（6）滴加封闭血清，室温10min。
（7）倾去血清，滴加一抗，4℃冰箱过夜，NF-κBp65滴度1：
50。
（8）PBS冲洗，滴加二步法免疫组化试剂，室温孵育30min。
（9）PBS冲洗，用新鲜配制的DAB显色液显色5~10min，镜下控制。
（10）自来水充分水洗，蒸馏水洗5～10min，苏木素复染，脱水、透明后中性树胶封片。
阳性染色为胞浆或胞核棕色颗粒。
以0.01mol/LPBS代替Ⅰ抗进行免疫组化阴性对照。
将已染好的切片在显微镜下放大200倍，随机选择不重叠的5个视野统计阳性细胞数量并经图像分析仪在计算机下测定其灰度值，测得的数据用（±s）表示，
1.3统计学处理
采用SPSS13.0统计软件进行析，计量以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。
，差异显著性检验采用方差分析和组间检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1七氟醚对MCAO大鼠脑梗死体积的影响
经TTC染色后，脑梗死区呈苍白色，梗死灶恒定的位于右侧大脑中动脉供血区域，即右侧大脑额、顶叶皮质、纹状体尾壳核及部分枕叶和海马。
缺血2h，再灌注24和72h后，IR组相对梗死体积百分比分别为37.4±7.4%、39.5±6.0%，Sevo1及Sevo2组对应时点相对梗死体积百分比分别为25.7±5.6%、28.3±4.5%及23.2±6.2%、26.0±4.4%。
和IR组比较，Sevo1组及Sevo2组再灌注24、72h后脑梗死体积显著减少（P<0.05）；Sevo2组与Sevo1组相比，梗死体积百分比虽有所减少，但差异无统计学意义（P>0.05）（见图1）。
图1：
缺血2h再灌注24，72h后各组脑梗死容积百分比的比较
※
※
§
§
§表示与IR24h组相比（P<0.05）；※表示与IR72h组相比（P<0.05）；
2.2七氟醚对NF-κBp65阳性表达情况的影响
NF-κBp65阳性反应主要表现为胞浆或胞核的棕黄色深染。
在IR组缺血对侧可见少量弱阳性反应的神经元细胞，而阳性反应主要分布在额、顶叶皮质和纹状体尾壳核部位缺血区的神经元。
Sevo1及Sevo2组，与IR组相比，再灌注24h及72h两个时间点NF-κBp65蛋白阳性表达均有所减少，差异均有显著性（P<0.05），Sevo2组与Sevo1组相比，NF-κBp65蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1）。
表1缺血2h再灌注24，72h后各组NF-κB阳性细胞数（个/高倍视野）
Tab.1NumbersofNF-κBpositiveneuronsevaluatedat24and72hafterischemic-reperfusioninareaofparietalcortex
组别
n（鼠数）
再灌注24h
再灌注72h
IR组
5
59.4±8.8
51.3±7.2
Sevo1组
5
41.6±6.3★
37.0±9.7★★
Sevo2组
5
36.3±7.6★
33.4±4.7★★
★表示与IR24h组相比（P<0.01）；★★表示与IR72h组相比（P<0.01）
B
D
C
F
E
图1缺血侧顶叶皮层NF-κB免疫组织化学染色（×400）A：
缺血损伤组24h；
B：
缺血损伤组72h；C：
七氟醚1组24h；D：
2.5%七氟醚1组72h；E：
七氟醚2组24h；F七氟醚2组72h
Fig.1ImmunohistochemicallabelingofNF-κBpositiveneuronsinareaofparietalcortex.A：
IR24h;B：
IR72h;C：
Sevo124h;D：
Sevo172h;E：
Sevo224h;F:
Sevo272h;
3.讨论
迟发性预处理是一个涉及多种应激反应基因表达，并最终导致神经保护性蛋白合成的复杂过程，虽然迟发预处理的强度稍弱于早期预处理，但持续时间为后者的30～50倍，且早期相的保护作用不能反复刺激出现，而迟发相保护作用可以反复刺激出现，因此迟发相比早期相预处理有更广阔的临床应用前景，更重要的应用价值[6]。
脑梗死面积的变化被认为是评价预处理效果的客观指标，本研究使用局灶性脑缺血再灌注模型-MCAO，并于缺血前24h，单次给予2.5%或4.0%的七氟醚60min预处理，发现七氟醚能够通过显著减少脑梗死容积，增强大鼠对局灶性脑缺血损伤的耐受，产生显著的迟发性脑保护效应。
本组先前研究显示七氟醚通过降低TNF-α及IL-1β蛋白水平及mRNA表达对局灶性脑缺血再灌注损伤起迟发性保护作用[7]，但具体机制尚不清楚。
有研究认为，缺血-再灌注通过活化核因子NF-κB蛋白的表达，诱发TNF-α、IL-1，IL-6等促炎症因子过度表达，引发炎症反应造成神经元细胞的损伤。
NF-κB是一种核转录因子广泛存在于多种细胞和病毒中，可被许多因素如细胞因子、氧化剂等激活，进而参与多种基因的表达调控。
近年来的研究表明，NF-κB还存在于脑血管内皮细胞、神经元和神经胶质细胞中，当中枢神经系统缺血时，可被特异性激活，与脑缺血再灌注损伤的炎症机制密切相关[8]。
脑缺血再灌注可导致NF-κB的激活，激活后的NF-κB可高效诱导多种细胞因子、黏附分子和趋化因子等的表达，同时对参与炎症反应放大与延续（即级联瀑布效应）的多种酶的基因表达也具有重要的调控作用[9]。
本研究结果显示，脑缺血再灌注后，NF-κB的表达量显著增加，这表明局灶性脑缺血能够激活NF-κB，进一步产生炎症反应从而加重脑缺血再灌注损伤。
而应用七氟醚迟发性预处理能显著减少脑缺血再灌注后梗死灶容积，同时抑制缺血侧神经元NF-κB蛋白的表达。
Zhou[10]等在急性心肌缺血再灌注模型中证实七氟醚预处理可有效抑制NF-κB核移位及活化，进而通过抑制诸多与炎症反应相关基因的过度表达。
研究也证实TNF-α，IL-1等既是NF-κB的激动剂，又是NF-κB激活后表达增加的产物，形成一个正反馈，导致大量炎性产物的生成，而七氟醚可明显减少TNF-α，IL-1等炎性因子的释放[11]。
另外，许多研究表明七氟醚在临床剂量范围内具有脑保护作用，且呈剂量依赖性。
Canas等[12]报道七氟醚可剂量依赖性的减轻不同程度培养神经元缺氧无糖（oxygen-glucosedeprivationOGD）损伤引起的神经元死亡。
国内学者研究发现，4%和6%的七氟醚预处理海马脑片30min，可明显减轻OGD损伤，延长顺向群峰电位（orthodromicpopulationspike,OPS）消失的时间，OPS恢复率和恢复程度明显优于OGD损伤组，而2%的七氟醚与OGD组相比无统计学差异[13]。
但也有研究发现皮层神经元培养细胞的OGD模型中，1.0MAC，2.0MAC，3.0MAC七氟醚减轻细胞凋亡程度无明显差异[14]。
而单次给予七氟醚是否在活体大鼠缺血模型中也提供类似的剂量依赖性的迟发预处理效应尚不清楚。
本组试验使用2.5%及4.0%两个不同浓度的七氟醚，发现Sevo1组与Sevo2组之间对脑梗死容积及NF-κB蛋白表达的影响差异无统计学意义（P＞0.05），即未证实七氟醚在本模型中保护效应具有剂量依赖性。
以上结果存在差异的原因可能为预处理的方式及模型等方面的差别或者是当超过临床剂量时，吸入麻醉药的脑保护作用被其本身毒性作用掩盖。
总之，七氟醚迟发性预处理效应是有多种分子参与的一系列信号转导事件所组成的复杂级联反应，它开始于有效的预处理刺激，最终导致新的保护性蛋白合成，使神经元能更好的耐受随后而来的缺血再灌注损伤。
而抑制NF-κB的活化可能是七氟醚介导的迟发性脑保护机制之一，但通过何种途径或机制影响再灌注损伤神经组织中NF-κB的活化，尚需进一步探讨。
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