试验一质粒DNA的小量提取与纯化.docx

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试验一质粒DNA的小量提取与纯化

基因工程实验指导书

THEEXPERIMENTALGUIDEFORGENEENGINEERING

马月萍崔振波编写

东北大学理学院生物技术研究所

二零零六年一月

实验须知

上好实验课是学好基因工程原理学的重要环节，它使同学们在验证课堂上所学理论知识、加深理解教师讲授内容的同时，还能使同学们得到基本实验技术、技巧的锻炼，为将来从事生物学基因工程方面的研究打下一定基础，因此必须予以足够的重视。

为此，必须做到：

一、实验前预习实验指导书并复习有关内容

二、按实验指导及教师的要求进行观察，记载，写好实验报告，字迹要整洁、清楚。

三、爱护实验仪器、设备，注意节约药品和各种实验材料，按操作规程使用仪器，严禁私自拆卸仪器及调整仪器附件，如有损坏，照价赔偿。

四、注意安全，严格遵守操作规程，如遇特殊情况应及时报告指导教师。

五、保持实验室安静，不得在实验室内喧哗，不得迟到和早退，实验完毕将实验用品放回原来位置，各组轮流打扫卫生。

目录

实验一质粒DNA的小量提取与纯化-1-

实验二限制性内切酶消化质粒DNA-5-

实验三感受态细胞的制备-7-

实验四聚合酶链式反应（PCR）体外扩增质粒DNA-11-

实验五大分子DNA的制备-15-

实验六Southern杂交-19-

实验七RNA的制备及Northern杂交分析-25-

参考文献-32-

实验一质粒DNA的小量提取与纯化

一实验目的

1．学习质粒DNA的制备原理。

2．掌握用碱变性抽提法提取与纯化质粒DNA操作技术。

3．掌握水平式琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA技术。

二实验原理

质粒是一类在细菌细胞内发现的，是存在于细胞质中的一类独立于染色体外，能够自主复制的环形双链的DNA分子。

质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒DNA编码的蛋白质往往赋予寄主细胞一定的表型特征，如各种抗性质粒、降解性质粒、致病性质粒等。

质粒DNA的提取与纯化是基因工程操作中常用的一项技术。

质粒DNA的制备方法很多，其中常用的是碱裂解法小量制备质粒DNA。

一般它们包括三个基本的步骤：

细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA的提取；质粒DNA的纯化。

1．细菌的生长和质粒的扩增

从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养，对于高拷贝的质粒（pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA，但对于拷贝数较低的质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。

因为氯霉素可以抑制寄主菌的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，但是质粒则仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续上升。

2．细菌的收集、裂解和质粒DNA提取

细菌的收集可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采取多种方法，包括用非离子型去污剂、有机溶剂或碱处理及加热处理等。

质粒DNA提取的基本原理是利用寄主菌（一般是大肠杆菌）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：

（1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。

（2）从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。

（3）环状质粒DNA较细菌的基因组DNA耐碱性强，细菌裂解物用碱性缓冲液处理后细菌的基因组DNA首先被裂解，通过离心与菌体碎片和各种蛋白质一起沉淀下来，环状质粒DNA存在于上清液中。

3．质粒DNA的纯化

纯化质粒DNA的方法很多，通常使用的方法都是利用了质粒DNA相对较小和共价闭合环状这两个基本性质。

多年来，绿化铯-溴化乙锭剃度平衡离心一直是制备大量质粒DNA的首选方法，然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多代替方法，其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析，分级沉淀（聚乙二醇和LiCl分级沉淀法）等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。

对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质及RNA，达到纯化的目的。

质粒DNA分子具有三种构型：

共价闭合环形DNA（cccDNA,SC构型）、开环DNA（OC构型）和线性分子（L构型）在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。

在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。

其中走在最前沿的是SCDNA，其后依次是LDNA和OCDNA。

三实验器材、试剂及材料

1．实验器材

超净工作台、台式离心机、微量加样器、恒温培养箱、恒温摇床、核酸电泳仪、电泳槽、小型混合器、冰箱、试管、1.5ml离心管

2．实验试剂

（1）LB培养基1L

蛋白胨10g

酵母浸膏5g

NaCl10g

固体加15gAgar,定容至1L后，高压灭菌20分钟

（2）溶液I

50mmol/L葡萄糖

25mmol/LTris.Cl（pH8.0）

10mmol/LEDTA（pH8.0）

一次配制100ml,然后高压灭菌15分钟。

4℃保存。

（3）溶液II（现用现配）

0.2mol/LNaOH

1%SDS

（4）溶液III

5mol/L乙酸钾60ml

冰乙酸11.5ml

双蒸水28.5ml

配制好的溶液III含有3mol/L钾盐，5mol/L醋酸（pH4.8）

（5）乙醇

（6）RNA酶

（7）50xTAE缓冲液：

242gTris-碱，57.1ml冰醋酸，100ml0.5MEDTA（pH8.0）,定容至1000ml.（用时稀释为1x）

（8）0.8%琼脂糖

（9）6x凝胶加样缓冲液:

0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（w/v）蔗糖水溶液。

3．实验材料

大肠杆菌：

Top10

亚克隆载体：

pUC19,2.68kb

四实验步骤

1．碱法小量制备质粒DNA

（1）挑取新鲜琼脂培养板上的单菌落，接种在3mlLB培养液中（含50μg/ml氨苄青霉素），37℃振荡培养过夜。

（2）取1-1.5ml培养液移到1.5ml离心管中，12000rpm离心1分钟,收集菌体。

（3）弃上清，将细菌沉淀悬浮于100μl冰预冷的溶液I中，强烈振荡混匀，室温搁置5分钟。

（4）加200μl溶液II，盖严管盖颠倒离心管几次以混合内容物，不要强烈振荡，置冰上5分钟,使细胞膜完全裂解。

（5）加150μl溶液III，倒转几次混匀，冰上放置10分钟。

此时酸中和碱，质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不溶性复合物，同时钾盐使游离SDS沉淀。

（6）12000rpm离心5分钟，沉淀染色体DNA及不溶的变性蛋白，取上清到一个新的离心管中。

（7）上清液用等体积的Tris-HCl饱和酚：

氯仿：

异戊醇（25:

24:

1）抽提1~2次。

（8）上清液用等体积的氯仿：

异戊醇（24:

1）抽提1次。

（9）上清液加2倍体积的无水乙醇，混匀后室温放置10分钟

（10）12000rpm离心10分钟得到质粒DNA沉淀。

（11）弃上清，加1ml70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5分钟。

（12）弃上清，将管倒置放在滤纸上，待乙醇完全蒸发。

（13）加入30μlTE缓冲液或ddH2O，溶解DNA，加入1µlRNaseA后混匀，37℃30分钟，消化小分子RNA。

-20℃放置备用。

2．质粒DNA的快速电泳检测

质粒DNA的浓度通常通过电泳来估算，取2ul质粒加入上样指示剂，进行琼脂糖凝胶电泳分析

3．1%琼脂糖凝胶的配制

（1）加100mlTAE或TBE缓冲液于三角瓶中。

（2）称取1克琼脂糖，于微波炉中加热至完全熔化

（3）冷却至60℃左右。

（4）加上溴化乙锭母液（100mg/ml）至终浓度为0.5ug/ml（5ul）,轻轻摇匀。

　注：

溴化乙锭（EB）为剧毒物，操作请戴手套。

（5）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。

（6）将胶板除去封胶带，加入电泳缓冲液（TAE或TBE）中，轻轻拔除梳子，即可上样。

五注意事项

1．菌体生长时，一般新复壮的菌落为3~4小时，保存的菌落常需要12小时甚至更久，菌数不能太浓，因为衰老期的菌体其内源性DNase的释入，使得不易提取质粒，但是菌体数太低质粒将太少。

2．菌液离心后，上清应除干净，以免影响后面的酶切。

3．抽提用的苯酚和氯仿不能残留，否则将影响酶切。

4．沉淀后，用乙醇洗涤操作要适当，既要洗尽盐又要防止质粒的流失过多。

六思考题

1．高拷贝的质粒为什么不需要在含抗性的培养基中进行选择培养？

2．如何将质粒DNA与寄主染色体DNA分离开？

3．质粒DNA分子有几种构型，在琼脂糖凝胶中迁移率如何分辨？

4．溶液II的作用是什么？

5．DNA分子在电泳缓冲液中带正电荷还是负电荷，在电场中的移动方向如何？

实验二限制性内切酶消化质粒DNA

一实验目的

1．掌握限制性内切酶消化质粒DNA的原理及其操作方法。

2．进一步学习水平式琼脂糖凝胶电泳的操作方法。

二实验原理

限制性内切酶是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。

细菌细胞内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。

它们对DNA底物有相同的识别序列，但生物功能却相反。

由于细胞内存在DNA甲基化酶，它能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化，就避免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破坏，而对感染的外来噬菌体DNA，因无甲基化而被切割破坏。

所以限制性内切酶是该细菌细胞的卫士，它与DNA甲基化酶一起构成了保护自己的、抵抗外源入侵的DNA的防御机制。

如果入侵的噬菌体DNA没有完全被限制性内切酶切割破坏，残留的噬菌体DNA在复制时，由于DNA甲基化酶的存在，同样地也在识别部位进行修饰---甲基化。

限制性内切酶对这种复制后的噬菌体DNA就奈何不得，以至大量繁殖起来，使受体细胞也因此遭到灭顶之灾。

目前发现的限制性内切酶有数百种。

EcoRI和HindIII都属于II型限制性内切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。

EcoRI和HindIII的识别序列和切口是：

EcoRI：

GAATTC

HindIII：

AAGCTT

G，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。

限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。

质粒的加工需要工具酶，限制性内切酶是重要的工具酶之一。

将质粒和外源基因用限制性内切酶酶切，再经过退火DNA连接酶封闭切口，便可获得携带外源基因的重组质粒。

重组质粒可以转移到另一个生物细胞中去，进而复制、转录和表达外源基因产物。

这样通过基因工程可获得所需要各种蛋白质产物。

三实验器材、试剂及材料

1．实验器材

超净工作台、恒温水浴锅、台式离心机、微量加样器、核酸电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、冰箱、1.5ml离心管、一次性手套

2．实验试剂

无菌H2O、10×酶切缓冲液、EcoRI限制性内切酶、电泳加样缓冲液、琼脂糖、1×TAE缓冲液

３．实验材料：

质粒DNA（pUC19）

四实验步骤

1．混合下列溶液于一个无菌的1.5ml离心管中，形成20μl的反应体系。

无菌H2O14μl

质粒DNA3μl

10×酶切缓冲液2μl

EcoRI限制性内切酶1μl

上述离心管内反应液混合均匀，然后置于37℃恒温水浴锅中温育2h。

2．从恒温水浴锅中取出装有反应液的离心管，加入4μl电泳加样缓冲液终止反应，混匀。

用0.8%水平式琼脂糖凝胶电泳和紫外透射仪鉴定酶切结果。

五注意事项

DNA制品中的污染（如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高盐浓度）均能抑制酶切活性。

这种抑制可通过增加酶作用单位数（10-20U/µgDNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间来加以克服。

六思考题

1．常用的限制性内切酶属于哪一类内切酶，切割能产生几种末端？

2．影响限制性内切酶的因素有哪些？

如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动,你认为可能是什么原因？

3．用双酶切时需要考虑哪些因素？

不能用同一种缓冲液时，该如何进行酶切？

4．琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？

实验三感受态细胞的制备

一实验目的

1．掌握感受态细胞的制备的原理和技术

2．掌握转化的技术和方法

二实验原理

在克隆技术中，转化（transformation）特指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

转染（transfection）是指噬菌体、病毒或以它作为载体构建的重组子导入细胞的过程。

对于以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程，有人称之为转导（transduction）。

转化这一概念来源于遗传学：

细菌细胞吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。

转化是一个自然存在的过程。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。

这项技术始于Mandel和Higa1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理及短暂热休克后，容易被入噬菌体DNA感染。

随后Cohn于1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也能进入细菌。

CaCl2转化法的基本原理是：

细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基一钙磷酸复合物粘附于细胞表面：

经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物；在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中的外源基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

在CaCl2转化法的基础上，人们逐渐探讨了其它化学转化法，如MgCl2、CoCl2等。

也有人对CaCl2转化法加以改进。

另外电击转化法由于操作简便，转化率较高而越来越为人们所接受。

三实验器材、试剂及材料

1．实验器材

无菌工作台，小型高速离心机，恒温摇床，恒温箱，-20℃冰箱，恒温水浴器，吸头，枪，试管，培养皿，1.5ml离心管

2．实验试剂

LB液体培养基，LA液体培养基及LA琼脂平板，0.1mol／LCaCl2（CaCl2先配制成lmol／L，用0.22μm的滤膜过滤后贮存，使用前稀释至0.1mol/L，并用0.45μm的滤膜过滤后使用）。

3．实验材料

大肠杆菌：

Top10或DH5α菌株，

四实验步骤（CaCl2转化法）

1．感受态细胞的制备

（1）宿主菌DH5α在LB培养基上划线，37℃培养16~20小时。

（2）挑单菌落移至含3mlLB的试管中，37℃强烈振荡培养过夜。

（3）第二天早测OD600值，经计算取出一定体积加入50mlLB中，使OD600约为0.015。

37℃振荡培养大约三小时，测试OD600值至0.5~0.6，这时细菌生长大约在对数生长期。

（4）将50ml培养基分至两个50ml离心管中，4℃，4000rpm离心10分钟。

（5）除尽上清液。

（6）共加入17m1（50ml的1／3倍）0.1M预冷的CaCl2（可先用lml重悬沉淀）。

（7）置于冰上30分钟。

（8）4℃，3000rpm离心10分钟。

（9）去掉上清。

（10）加入2mlCaCl2重悬细菌沉淀，分装。

（11）可立即使用或保存于4℃（不宜超过一周），或加15%甘油于-70℃保存。

2．转化

（1）对于已构建成功的高浓度重组质粒，取50μl感受态细胞，加入0.5μl重组质粒DNA；对于连接反应产物，一般加入3~5μl连接反应产物。

（2）置于冰上30分钟。

（3）于42℃热激90秒，立即置于冰上，3-5分钟后补加LB液体（无抗生素）800ul，于37℃振荡培养大约1小时。

（4）取（3）中转化菌适量（200μl），涂布于LB平板（氨卞青霉素50ug/ml）。

37℃过夜培养，通过质粒DNA提取鉴定重组子。

五注意事项

1．CaCl2浓度

Ca2+浓度是影响转化的重要因素。

随着CaCl2浓度的提高，转化效率提高，在0.075~0.1M时达到峰值，而超过0.1M效率反而下降。

2．感受态细胞的保存

后冰浴法制备的感受态细胞保存时间为30分钟时，转化效率和常规法无显著差异。

感受态细胞在4℃保存的时间越长转化效率越高，3天左右达到峰值，随后逐渐吓降，但两周之内使用均可。

六思考题

1．什么叫感受态？

2．为什么使用对数生长期的菌体细胞制备感受态？

3．影响转化成功的因素有哪些？

4．在感受态细胞制备与转化过程中为什么始终需要冰浴环境？

实验四聚合酶链式反应（PCR）体外扩增质粒DNA

一实验目的

掌握聚合酶链式反应（PCR）的原理及其操作方法。

二实验原理

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。

典型的PCR反应由高温变性、低温退火和适温延伸等三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。

其主要步骤是将待扩增的DNA置于高温下使之解链；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与DNA两条链互补结合；DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，沿模板从5’向3’方向延伸，合成DNA的新互补链。

PCR技术能在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的某一特定的目的DNA片段扩增106倍以上，而无需经过烦琐的基因克隆程序便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。

它操作简单，易于掌握，结果也较为可靠，为基因的分析和研究提供了一种强有力的手段，对整个生命科学的研究与发展都有深远的影响。

因此，得到广泛应用。

可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析、突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制的探索及法医鉴定等诸多方面。

PCR技术在分子克隆和DNA分析中有着如下多种用途：

1．制备双链DNA中的特异序列作为探针；

2．由少量mRNA制备cDNA文库；

3．由cDNA克隆某些基因；

4．制备大量DNA以进行序列测定；

5．突变的分析；

6．染色体步移；

7．RAPD、AFLP、RFLP、等DNA多态性分析。

PCR反应体系应具备以下原料：

DNA模板、寡核苷酸DNA引物、热稳定的DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）、反应缓冲液，脱氧核苷三磷酸底物dNTP等五部分组成，缺一不可：

1．模板

单双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。

若起始材料是RNA，一般须先通过逆转录得到第一链cDNA。

虽然PCR可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的染色体DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。

原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。

2．引物：

引物是决定PCR结果的关键因素，下列原则有助于引物的合理设计：

（1）引物的长度以15~30bp为宜，其Tm=4（G+C）+2（A+T）,一般（G+C）的含量在45~55%，应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列（尽量避免有三个以上连续相同的碱基），碱基的分布应是随机的。

（2）两个引物在3’端不应出现同源性，避免引物形成内部二级结构，3’端的末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率，研究表明选T，G，C为最好。

（3）人工合成的寡聚核苷酸引物最好经过PAGE或离子交换HPLC进行纯化。

（4）引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端，一是容易形成引物二聚体（primer-dimer）,二是当扩增微量靶目标并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异产物。

一般来说，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性比较好，一般用0.25~0.5pmol/µl较好。

（5）新订的引物来了以后，在未开盖前稍加离心，然后用TE配成较高浓度的母液（约100µM），保存于-20℃。

取出其中一部分用ddH2O配制成10µM或20µM的工作液。

3．Taq酶的用量

在100µl反应液中，一般加入2.5U的酶量，足以达到每分钟延伸1000~4000个核苷酸的掺入速度。

酶量过多导致产生非特异性产物。

但是不同的公司或不同批次的产品常有很大的不同。

由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当进行预实验。

一般100µl反应混合物用2~4U酶较为合适。

4．反应缓冲液

用于PCR的标准缓冲液含：

50mMKCl,10mMHCl（pH8.3,室温）和1.5mMMgCl2。

Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有显著影响。

浓度过高，反应特异性降低，浓度过低，使产物减少。

在各种单核苷酸浓度为200µM时，Mg2+为1.5mM较合适。

若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。

在高浓度DNA及dNTPs条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度，一般以1.5~2mM（终浓度）较好。

5．dNTP的浓度

高浓度dNTP易产生错误掺入；而浓度过低，则降低反应产物的产量。

PCR常用终浓度为50~400µM的dNTPs。

四种脱氧三磷酸单核苷酸的浓度应相同。

如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时，就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。

此外，dNTPs能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

因此，dNTPs的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。

三实验器材、试剂及材料

1．实验器材

TC-512PCR仪、超净工作台、台式离心机、微量加样器、核酸电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外透射仪、0.2ml离心管、一次性手套

2．实验试剂

dNTP、Taq酶、模板质粒DNA、引物、10×PCR缓冲液、无菌H2O、电泳加样缓冲液、琼脂糖、1×TAE缓冲液

四实验步骤

1．在0.2ml离心管依次加入下列反应产物：

样品

对照

无菌H2O

15.0μl

16.0μl

10×PCR缓冲液

2μl

2μl

dNTP（10mMeach）

0.5μl

0.5μl

引物（10µM）

0.5μl

0.5μl

引物（10µM）

0.5μl

0.5μl

模板质粒DNA

1.0μl

0.0μl

Taq酶

0.5μl

0.5μl

总计

20.0μl

20.0μl

将上述试剂在微量离心管中仔细混匀，尽量避免产生气泡。

置于离心机上迅速离心片刻。

2．在PCR仪上设定以下程序：

94℃变性5min，1个循环

94℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸1min；30个循环

72℃延伸10min，1个循环

3．将样品置于PCR仪上进行扩增

4．用0.8%水平式琼脂糖凝胶电泳和紫外透射仪鉴定PCR结果。

五注意事项

1．PCR反应应该在一个没有DNA的干净环境中进行

2．所用的所有溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染。

3．所有PCR试剂中使用的水都应该用新鲜蒸馏的去离子水高压灭菌后分装备用。

4．所有试剂或样品准备过程中都要使