试验一质粒DNA的小量提取与纯化.docx

1、试验一质粒DNA的小量提取与纯化基因工程实验指导书THE EXPERIMENTAL GUIDE FOR GENE ENGINEERING马月萍 崔振波 编写东北大学理学院生物技术研究所二零零六年一月实验须知上好实验课是学好基因工程原理学的重要环节，它使同学们在验证课堂上所学理论知识、加深理解教师讲授内容的同时，还能使同学们得到基本实验技术、技巧的锻炼，为将来从事生物学基因工程方面的研究打下一定基础，因此必须予以足够的重视。为此，必须做到：一、 实验前预习实验指导书并复习有关内容二、 按实验指导及教师的要求进行观察，记载，写好实验报告，字迹要整洁、清楚。三、 爱护实验仪器、设备，注意节约药品和各

2、种实验材料，按操作规程使用仪器，严禁私自拆卸仪器及调整仪器附件，如有损坏，照价赔偿。四、 注意安全，严格遵守操作规程，如遇特殊情况应及时报告指导教师。五、 保持实验室安静，不得在实验室内喧哗，不得迟到和早退，实验完毕将实验用品放回原来位置，各组轮流打扫卫生。目 录实验一 质粒DNA的小量提取与纯化 - 1 -实验二 限制性内切酶消化质粒DNA - 5 -实验三 感受态细胞的制备 - 7 -实验四 聚合酶链式反应（PCR）体外扩增质粒DNA - 11 -实验五 大分子DNA的制备 - 15 -实验六 Southern杂交 - 19 -实验七 RNA的制备及Northern杂交分析 - 25 -参

3、考文献 - 32 -实验一 质粒DNA的小量提取与纯化一 实验目的1学习质粒DNA的制备原理。2掌握用碱变性抽提法提取与纯化质粒DNA操作技术。3掌握水平式琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA技术。二 实验原理质粒是一类在细菌细胞内发现的，是存在于细胞质中的一类独立于染色体外，能够自主复制的环形双链的DNA分子。质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒DNA编码的蛋白质往往赋予寄主细胞一定的表型特征，如各种抗性质粒、降解性质粒、致病性质粒等。质粒DNA的提取与纯化是基因工程操作中常用的一项技术。质粒

4、DNA的制备方法很多，其中常用的是碱裂解法小量制备质粒DNA。一般它们包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA的提取；质粒DNA的纯化。1细菌的生长和质粒的扩增从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养，对于高拷贝的质粒（pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA，但对于拷贝数较低的质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。因为氯霉素可以抑制寄主菌的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，但

5、是质粒则仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续上升。2细菌的收集、裂解和质粒DNA提取细菌的收集可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采取多种方法，包括用非离子型去污剂、有机溶剂或碱处理及加热处理等。质粒DNA提取的基本原理是利用寄主菌（一般是大肠杆菌）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：（1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。（2）从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。（3）环状质粒DNA较细菌的基因组DNA耐碱性强，细菌裂解物用碱性缓冲液处理后细菌的基因组DNA首先被裂解，通过离心与菌体碎片和各种蛋白质一起沉淀下来，环状

6、质粒DNA存在于上清液中。3质粒DNA的纯化纯化质粒DNA的方法很多，通常使用的方法都是利用了质粒DNA相对较小和共价闭合环状这两个基本性质。多年来，绿化铯-溴化乙锭剃度平衡离心一直是制备大量质粒DNA的首选方法，然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多代替方法，其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析，分级沉淀（聚乙二醇和LiCl分级沉淀法）等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质及RNA，达到纯化的目的。质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环形DNA（cccDNA, SC构型）、开环DNA（OC构型）和线性分

7、子（L构型）在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA。三 实验器材、试剂及材料1实验器材超净工作台、台式离心机、微量加样器、恒温培养箱、恒温摇床、核酸电泳仪、电泳槽、小型混合器、冰箱、试管、1.5ml离心管2实验试剂（1）LB培养基 1L蛋白胨 10g酵母浸膏 5gNaCl 10g固体加15g Agar,定容至1L后，高压灭菌20分钟（2）溶液I50mmol/L 葡萄糖25 mmol/L Tris.Cl（pH8.0）10mmol/L ED

8、TA（pH8.0）一次配制100ml, 然后高压灭菌15分钟。4保存。（3）溶液II（现用现配）0.2mol/L NaOH1% SDS（4）溶液III 5mol/L 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 双蒸水 28.5ml配制好的溶液III含有3mol/L钾盐，5mol/L醋酸（pH4.8）（5）乙醇（6）RNA酶（7）50 x TAE缓冲液：242g Tris-碱，57.1ml 冰醋酸，100ml 0.5M EDTA(pH8.0),定容至1000ml.(用时稀释为1x)（8）0.8%琼脂糖（9）6x凝胶加样缓冲液: 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（w/v）蔗糖水溶液。3

9、实验材料大肠杆菌：Top10亚克隆载体：pUC19, 2.68kb四 实验步骤1碱法小量制备质粒DNA（1）挑取新鲜琼脂培养板上的单菌落，接种在3ml LB培养液中（含50g/ml 氨苄青霉素），37振荡培养过夜。（2）取1-1.5ml培养液移到1.5ml离心管中，12000rpm离心1分钟, 收集菌体。（3）弃上清，将细菌沉淀悬浮于100l冰预冷的溶液I中，强烈振荡混匀，室温搁置5分钟。（4）加200l溶液II，盖严管盖颠倒离心管几次以混合内容物，不要强烈振荡，置冰上5分钟, 使细胞膜完全裂解。（5）加150l溶液III，倒转几次混匀，冰上放置10分钟。此时酸中和碱，质粒DNA复性，染色体和

10、蛋白质不可逆变性，形成不溶性复合物，同时钾盐使游离SDS沉淀。（6）12000rpm离心5分钟，沉淀染色体DNA及不溶的变性蛋白，取上清到一个新的离心管中。（7）上清液用等体积的Tris-HCl饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提12次。（8）上清液用等体积的氯仿：异戊醇（24:1）抽提1次。（9）上清液加2倍体积的无水乙醇，混匀后室温放置10分钟（10）12000rpm离心10分钟得到质粒DNA沉淀。（11）弃上清，加1ml 70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm离心5分钟。（12）弃上清，将管倒置放在滤纸上，待乙醇完全蒸发。（13）加入30lTE缓冲液或ddH2O，溶解DNA，加入1l

11、 RNaseA后混匀，37 30分钟，消化小分子RNA。-20放置备用。2质粒DNA的快速电泳检测质粒DNA的浓度通常通过电泳来估算，取2ul质粒加入上样指示剂，进行琼脂糖凝胶电泳分析31%琼脂糖凝胶的配制（1）加100ml TAE或TBE缓冲液于三角瓶中。（2）称取1克琼脂糖，于微波炉中加热至完全熔化（3）冷却至60左右。（4）加上溴化乙锭母液（100mg/ml）至终浓度为0.5ug/ml（5ul）,轻轻摇匀。 注：溴化乙锭（EB）为剧毒物，操作请戴手套。（5）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上。（6）将胶板除去封胶带，加入电泳缓冲液（TAE或TBE）中，轻轻拔除梳

12、子，即可上样。五 注意事项1菌体生长时，一般新复壮的菌落为34小时，保存的菌落常需要12小时甚至更久，菌数不能太浓，因为衰老期的菌体其内源性DNase的释入，使得不易提取质粒，但是菌体数太低质粒将太少。2菌液离心后，上清应除干净，以免影响后面的酶切。3抽提用的苯酚和氯仿不能残留，否则将影响酶切。4沉淀后，用乙醇洗涤操作要适当，既要洗尽盐又要防止质粒的流失过多。六 思考题1高拷贝的质粒为什么不需要在含抗性的培养基中进行选择培养？2如何将质粒DNA与寄主染色体DNA分离开？3质粒DNA分子有几种构型，在琼脂糖凝胶中迁移率如何分辨？4溶液II的作用是什么？5DNA分子在电泳缓冲液中带正电荷还是负电荷

13、，在电场中的移动方向如何？实验二 限制性内切酶消化质粒DNA一 实验目的1掌握限制性内切酶消化质粒DNA的原理及其操作方法。2进一步学习水平式琼脂糖凝胶电泳的操作方法。二 实验原理限制性内切酶是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌细胞内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。它们对DNA底物有相同的识别序列，但生物功能却相反。由于细胞内存在DNA甲基化酶，它能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化，就避免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破坏，而对感染的外来噬菌体DNA，因无甲基化而被切割破坏。所以限制性内切酶是该细菌细胞的卫士，它与DNA甲基化酶

14、一起构成了保护自己的、抵抗外源入侵的DNA的防御机制。如果入侵的噬菌体DNA没有完全被限制性内切酶切割破坏，残留的噬菌体DNA在复制时，由于DNA甲基化酶的存在，同样地也在识别部位进行修饰-甲基化。限制性内切酶对这种复制后的噬菌体DNA就奈何不得，以至大量繁殖起来，使受体细胞也因此遭到灭顶之灾。目前发现的限制性内切酶有数百种。EcoRI和HindIII都属于II型限制性内切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。EcoRI和HindIII的识别序列和切口是： EcoRI： G AATTC

15、 HindIII： A AGCTTG，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。质粒的加工需要工具酶，限制性内切酶是重要的工具酶之一。将质粒和外源基因用限制性内切酶酶切，再经过退火DNA连接酶封闭切口，便可获得携带外源基因的重组质粒。重组质粒可以转移到另一个生物细胞中去，进而复制、转录和表达外源基因产物。这样通过基因工程可获得所需要各种蛋白质产物。三 实验器材、试剂及材料1实验器材超净工作台、恒温水浴锅、台式离心机、微

16、量加样器、核酸电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、冰箱、1.5ml离心管、一次性手套2实验试剂无菌H2O、10酶切缓冲液、EcoRI限制性内切酶、电泳加样缓冲液、琼脂糖、1TAE缓冲液实验材料：质粒DNA（pUC19）四 实验步骤1混合下列溶液于一个无菌的1.5ml离心管中，形成20l的反应体系。无菌H2O 14l质粒DNA 3l 10酶切缓冲液 2lEcoRI限制性内切酶 1l上述离心管内反应液混合均匀，然后置于37恒温水浴锅中温育2h。2从恒温水浴锅中取出装有反应液的离心管，加入4l电泳加样缓冲液终止反应，混匀。用0.8%水平式琼脂糖凝胶电泳和紫外透射仪鉴定酶切结果。五 注意事项DNA制品中的污染

17、（如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高盐浓度）均能抑制酶切活性。这种抑制可通过增加酶作用单位数（10-20U/g DNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间来加以克服。六 思考题1常用的限制性内切酶属于哪一类内切酶，切割能产生几种末端？2影响限制性内切酶的因素有哪些？如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动,你认为可能是什么原因？3用双酶切时需要考虑哪些因素？不能用同一种缓冲液时，该如何进行酶切？4琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？实验三 感受态细胞的制备一 实验目的1掌握感受态细胞的制备的原理和技术2掌握转化的技术和方法二 实验原理在克隆技术中，转

18、化（transformation）特指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染（transfection）是指噬菌体、病毒或以它作为载体构建的重组子导入细胞的过程。对于以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程，有人称之为转导（transduction）。转化这一概念来源于遗传学：细菌细胞吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。转化是一个自然存在的过程。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。这项技术始于Mandel和Higa1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的

19、CaCl2溶液处理及短暂热休克后，容易被入噬菌体DNA感染。随后Cohn于1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也能进入细菌。CaCl2转化法的基本原理是：细菌处于0，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基一钙磷酸复合物粘附于细胞表面：经42短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物；在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中的外源基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。在CaCl2转化法的基础上，人们逐渐探讨了其它化学转化法，如MgCl2、CoCl2等。也有人对CaCl2转化法加以改进。另外电击转化法由于

20、操作简便，转化率较高而越来越为人们所接受。三 实验器材、试剂及材料1实验器材无菌工作台，小型高速离心机，恒温摇床，恒温箱，-20冰箱，恒温水浴器，吸头，枪，试管，培养皿，1.5ml离心管2实验试剂LB液体培养基，LA液体培养基及LA琼脂平板，0.1molLCaCl2（CaCl2先配制成lmolL，用0.22m的滤膜过滤后贮存，使用前稀释至0.1mol/L，并用0.45m的滤膜过滤后使用）。3实验材料大肠杆菌： Top10或 DH5菌株，四 实验步骤（CaCl2转化法）1感受态细胞的制备（1）宿主菌DH5在LB培养基上划线，37培养1620小时。（2）挑单菌落移至含3ml LB的试管中，37强烈

21、振荡培养过夜。（3）第二天早测OD600值，经计算取出一定体积加入50ml LB中，使OD600约为0.015。37振荡培养大约三小时，测试OD600值至0.50.6，这时细菌生长大约在对数生长期。（4）将50ml培养基分至两个50ml离心管中，4，4000rpm离心10分钟。（5）除尽上清液。（6）共加入17m1（50ml的13倍）0.1M预冷的CaCl2（可先用lml重悬沉淀）。（7）置于冰上30分钟。（8）4，3000rpm离心10分钟。（9）去掉上清。（10）加入2ml CaCl2重悬细菌沉淀，分装。（11）可立即使用或保存于4（不宜超过一周），或加15%甘油于-70保存。2转化（1）

22、对于已构建成功的高浓度重组质粒，取50l感受态细胞，加入0.5l重组质粒DNA；对于连接反应产物，一般加入35l连接反应产物。（2）置于冰上30分钟。（3）于42热激90秒，立即置于冰上，3-5分钟后补加LB液体（无抗生素）800ul，于37振荡培养大约1小时。（4）取（3）中转化菌适量（200l），涂布于LB平板（氨卞青霉素50ug/ml）。 37过夜培养，通过质粒DNA提取鉴定重组子。五 注意事项1CaCl2浓度Ca2+浓度是影响转化的重要因素。随着CaCl2浓度的提高，转化效率提高，在0.0750.1M时达到峰值，而超过0.1M效率反而下降。2感受态细胞的保存后冰浴法制备的感受态细胞保存

23、时间为30分钟时，转化效率和常规法无显著差异。感受态细胞在4保存的时间越长转化效率越高，3天左右达到峰值，随后逐渐吓降，但两周之内使用均可。六 思考题1什么叫感受态？2为什么使用对数生长期的菌体细胞制备感受态？3影响转化成功的因素有哪些？4在感受态细胞制备与转化过程中为什么始终需要冰浴环境？实验四 聚合酶链式反应（PCR）体外扩增质粒DNA一 实验目的掌握聚合酶链式反应（PCR）的原理及其操作方法。二 实验原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。典型的PCR反应由高温变性、低温退火和适温延伸等三步反应组成一个

24、循环周期，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是将待扩增的DNA置于高温下使之解链；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与DNA两条链互补结合；DNA聚合酶在72将单核苷酸从引物的3端开始掺入，沿模板从5向 3方向延伸，合成DNA的新互补链。PCR技术能在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的某一特定的目的DNA片段扩增106倍以上，而无需经过烦琐的基因克隆程序便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。它操作简单，易于掌握，结果也较为可靠，为基因的分析和研究提供了一种强有力的手段，对整个生命科学的研究与发展都有深远的影响。因此，得到广泛应用。可用于基因的分离、

25、克隆和核苷酸序列分析、突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制的探索及法医鉴定等诸多方面。PCR技术在分子克隆和DNA分析中有着如下多种用途：1制备双链DNA中的特异序列作为探针；2由少量mRNA制备cDNA文库；3由cDNA克隆某些基因；4制备大量DNA以进行序列测定；5突变的分析；6染色体步移；7RAPD、AFLP、RFLP、等DNA多态性分析。PCR反应体系应具备以下原料：DNA模板、寡核苷酸DNA引物、热稳定的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、反应缓冲液，脱氧核苷三磷酸底物dNTP等五部分组成，缺一不可：1模板单双链DNA或RNA都

26、可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，一般须先通过逆转录得到第一链cDNA。虽然PCR可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般还宜用g水平的染色体DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。2引物：引物是决定PCR结果的关键因素，下列原则有助于引物的合理设计：（1）引物的长度以1530bp为宜，其Tm = 4（G+C）+2（A+T）,一般（G+C）的含量在4555%，应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列（尽量避免有三个以上连续

27、相同的碱基），碱基的分布应是随机的。（2）两个引物在3端不应出现同源性，避免引物形成内部二级结构，3端的末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率，研究表明选T，G，C为最好。（3）人工合成的寡聚核苷酸引物最好经过PAGE或离子交换HPLC进行纯化。（4）引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端，一是容易形成引物二聚体（primer-dimer）, 二是当扩增微量靶目标并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异产物。一般来说，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性比较好，一般用0.250.5pmol/l较好。（5）新订的引物来了以后，在未开盖前稍加离心，然后用TE配成较高浓度的母液（约100M），保存

28、于-20。取出其中一部分用ddH2O配制成10M或20M的工作液。3Taq酶的用量在100l反应液中，一般加入2.5U的酶量，足以达到每分钟延伸10004000个核苷酸的掺入速度。酶量过多导致产生非特异性产物。但是不同的公司或不同批次的产品常有很大的不同。由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当进行预实验。一般100l反应混合物用24U酶较为合适。4反应缓冲液用于PCR的标准缓冲液含：50mM KCl,10mM HCl（pH8.3,室温）和1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有显著影响。浓度过高，反应特异性降低，浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200M时，Mg

29、2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTPs条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度，一般以1.52mM（终浓度）较好。5dNTP的浓度高浓度dNTP易产生错误掺入；而浓度过低，则降低反应产物的产量。PCR常用终浓度为50400M的dNTPs。四种脱氧三磷酸单核苷酸的浓度应相同。如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时，就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTPs能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTPs的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。三 实验器材、试剂及

30、材料1实验器材TC-512 PCR仪、超净工作台、台式离心机、微量加样器、核酸电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外透射仪、0.2ml离心管、一次性手套2实验试剂dNTP、Taq酶、模板质粒DNA、引物、10PCR缓冲液、无菌H2O、电泳加样缓冲液、琼脂糖、1TAE缓冲液四 实验步骤1在0.2ml 离心管依次加入下列反应产物：样品对照无菌H2O15.0l16.0l10PCR缓冲液2l2ldNTP(10mM each)0.5l0.5l引物(10M)0.5l0.5l引物(10M)0.5l0.5l模板质粒DNA1.0l0.0lTaq酶0.5l0.5l总计20.0l20.0l将上述试剂在微量离心管中仔细混匀，尽量避免产生气泡。置于离心机上迅速离心片刻。2在PCR仪上设定以下程序：94变性5min，1个循环94变性1min；55退火1min；72延伸1min；30个循环72延伸10min，1个循环3将样品置于PCR仪上进行扩增4用0.8%水平式琼脂糖凝胶电泳和紫外透射仪鉴定PCR结果。五 注意事项1PCR反应应该在一个没有DNA的干净环境中进行2所用的所有溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染。3所有PCR试剂中使用的水都应该用新鲜蒸馏的去离子水高压灭菌后分装备用。4所有试剂或样品准备过程中都要使