实验药理学第四篇1体内过程研究.docx

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实验药理学第四篇1体内过程研究

第四篇药物体内过程研究

第二十章药物体内过程研究方法

许多体外研究认为很有前途的候选化合物，因在体内活性很低甚至无体内活性或体内具有较大毒性而夭折，造成极大的人力和财力浪费。

缺乏体内活性可能是由于其药动学性质不理想：

如首过效应较强或不易通过肠粘膜被吸收，生物利用度太低；或代谢太快，半衰期太短；或不易通过生物膜而进入靶器官。

体内的毒性则可能是由于其在体内形成的毒性代谢物所致。

据文献报道进入临床试验后约有40%的候选化合物是由于药动学方面的原因而被淘汰的，这足以说明了解药物体内过程在创新药开发研究中的作用。

一个候选化合物不仅要有较高的体外活性，还应具有理想的药动学性质，即较高的生物利用度和理想的半衰期。

因此，在新药开发的早期阶段，可利用各种体内和体外模型对候选化合物药动学进行初筛，以便在研究开发早期就确定该候选化合物是否有继续开发的价值，并可根据筛选结果对先导化合物进行结构改造或修饰，以获得具有良好药动学特性的新候选化合物。

最优的候选化合物是从一次次的优化循环中诞生的，每一次的优化循环都通过药理学、毒理学和药动学筛选结果反馈来指导下一步合成或结构改造。

这样循环往复最终产生具有良好的药理学、毒理学和药动学特性的最佳候选化合物，进入下一步的临床研究。

第一节药物体内吸收特征预测研究

现代药物研发成功与否，与药物的体内过程密切相关。

目前，人工合成和筛选有限数量的化合物已被大规模的化合物合成和高通量筛选所取代。

无论是开发新药还是开发新的给药途径，化合物在体内的吸收特性都非常重要。

以往传统的体内药代吸收筛选模型，由于所需药物量大、难以批量化、耗时长以及费用高等弊端，已经无法满足现代新药的研发要求，因而开发新的快速、准确以及需药量少的药物吸收筛选模型已成为新药研发的必然趋势。

目前，被广泛采用的三种筛选方法是：

大鼠原位单次灌注法、大鼠外翻肠囊法以及体外人结肠腺癌（Caco-2）细胞系法。

其中，Caco-2细胞模型已经成为一种预测药物人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准体外筛选工具。

一、Caco-2细胞跨膜吸收转运模型

（一）Caco-2细胞结构、功能特征

Caco-2细胞模型最初是由Borchardt和Workem在1989年提出的。

1．与小肠有相似的酶表达：

该细胞系源于人体结肠癌细胞，其结构和生化作用都类似于人小肠上皮细胞，含有与刷状缘上皮细胞相关的酶系，如γ-谷氨酰胺转肽酶、碱性磷酸酶、谷肽甘肽-S-转移酶、磺基转移酶、细胞色素P-450酶系。

与小肠主动转运相关的12种转运系统（如糖、氨基酸、二肽、胆酸、维生素B12）也都在Caco-2细胞内表达。

2．与小肠有相似的细胞结构特征：

其来源于人的直肠癌，结构和功能类似于人小肠上皮细胞，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。

在细胞培养条件下，生长在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续的单层，这与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现反分化的情况不同。

细胞亚显微结构研究表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞在形态学上相似，具有相同的细胞极性和紧密连接。

胞饮功能的检测也表明，Caco-2细胞与人小肠上皮细胞类似，这些性质可以恒定维持约20天。

由于Caco-2细胞性质类似小肠上皮细胞，因此可以在这段时间进行药物的跨膜转运实验。

（二）用途

1．研究药物小肠吸收的标准工具

利用人小肠上皮Caco-2细胞单层来进行药物小肠吸收的细胞水平实验，现在已经成为一种预测药物在人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准筛选工具。

评价新药的吸收，如新药为水溶性很差的化合物，则药物性质决定其不能制作成注射剂。

为了改善其口服吸收生物利用度，国外研究人员使用了一些吸收增强剂，用Caco-2细胞来评价其吸收程度取得较好的结果。

还有研究者使用Caco-2细胞模型评价了系列难溶性药物磷酸酯前药与其母药的吸收度，这些药物包括可的松、苯妥英等。

结果发现，苯妥英等药物磷酯化后吸收大为增加，而可的松磷酯化后吸收程度有显著改变，这些结果在其他模型上也类似。

在研究药物赋形剂对药物吸收的影响时，同时使用了Caco-2细胞模型和大鼠离体肠道进行评价，两模型的结果一致。

这些都表明Caco-2细胞模型在新药吸收评价方面的重要价值。

2．预测吸收过程中的药物相互作用

Caco-2细胞中存在有与小肠上皮相同的各种转运系统、代谢酶，因此可以用来作为研究与吸收相关的药物相互作用的体外模型。

小肠上皮的代谢、受体介导的转运、P-gp对药物分子的泵出，是一个饱和过程。

联合用药时，因为有可能存在药物竞争酶、载体或P-gp泵的作用，所以会与单独给药时的生物利用度存在差异。

这种药物吸收过程中存在的相互作用可以应用Caco-2细胞模型进行研究。

此外，与药物吸收有关的相互作用还可来源于代谢酶、载体、P-gp泵被特定药物重复给药引起的诱导。

当药物经细胞转运途径被吸收时，P-gp泵成为药物吸收的一个重要生化屏障，它把进入细胞内的药物泵出，从而减少了药物的吸收，因此成为口服药物生物利用度低、波动大的一个重要影响因素。

具有这种P-gp泵出性质的药物分子在与P-gp泵抑制剂共同口服给药时，其透过细胞膜吸收的程度增强。

3．研究吸收机制

Caco-2细胞除了在吸收评价方面的大量应用外，也比较适合用于吸收机制的研究。

有研究者分别利用Caco-2细胞作为钠和铁吸收的模型细胞，结果发现，脂筏（lipidraft）在决定PI3K/AKT2信号转导过程中起到重要作用，包括增加了肠道的Na吸收。

4．药物小肠代谢研究

人体小肠中存在着丰富的细胞色素P450同工酶，其中P4503A4占到该组织中所有细胞色素P450同工酶的约50%，而其在Caco-2细胞单层中的表达已见报道。

与人体小肠甚至空肠微粒体相比，Caco-2细胞中的细胞色素P450同工酶为低水平表达，这是限制其作为口服给药化合物的小肠一相代谢研究模型的一个因素。

为了克服这一局限，国外研究人员等利用1α，25-二羟基维生素D3处理过的Caco-2细胞单层作为研究小肠代谢动力学首过作用的体外模型。

当将该系统应用于研究细胞色素P4503A4底物咪唑安定的代谢动力学时，显示出与体内研究相似的结果。

尽管细胞色素P450同工酶在Caco-2细胞中的表达水平较低，但其他许多药物代谢酶的表达水平不经诱导就可以用于药物小肠代谢的研究。

比如，像羧酸酯酶、葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽-S-转移酶、磺基转移酶和儿茶酚-O-甲基转移酶等在Caco-2细胞中仍保持其功能特点。

在这些酶中，二相磺基转移酶和葡萄糖醛酸转移酶对于口服给药化合物的生物利用度尤其重要，因为具有药理活性的化合物与它们发生结合反应后通常会导致活性降低或消失。

例如，人们已经发现在Caco-2细胞中，类黄酮物质5，7-二羟黄酮产生硫酸盐和葡（萄）糖苷酸的变化，5，7-二羟黄酮硫酸盐的产生速度是其葡（萄）糖苷酸化的两倍。

类似研究也表明，Caco-2细胞模型中酶的表达可以使其应用于药物的小肠代谢研究。

（三）研究方法

对Caco-2进行药物吸收研究采用transwell培养板，含有两个小池，在里面的小池底部有一层多孔渗水的半透膜，Caco-2细胞培养在半透膜上生长成单层汇合细胞。

实验时，将化合物加入上面的小池内，然后定时检测下面小池内药物浓度。

从而得出表现渗透参数。

单细胞层的完整性可以通过测定跨细胞层电阻，或测定低渗透参照化合物如PEG4000的转运率来衡量。

在P-gp抑制剂异搏定存在和缺乏时，通过测定P-gp的底物罗丹明123（Rhodamine123）123的转运率可以确定P-gp的表达水平。

（四）注意事项

但在应用这一模型时应注意，对于高通透性（即吸收良好）的候选化合物而言，其体内外的吸收往往具有良好的相关性，而对于中、低高通透性的候选化合物而言，其体内外的吸收的相关性不如前者。

因为有些低分子量且水溶性好的候选化合物在体外表现出较低的通透性，而在体内却吸收良好，这是由于这类化合物可能存在细胞旁通道或某种主动转运机制。

Caco-2细胞模型虽已被广泛用于体外吸收研究，但相对于高通量筛选的要求而言，其仍显得很费时，因此近年来一直在对其不断地加以改进，并建立了一些新的细胞模型，期望能够提高其筛选效率，以便其更适合于高通量筛选。

如采用3天的Caco-2细胞模型，3天的MDCK细胞模型、HT29细胞模型。

（五）存在的问题

细胞培养时间过长（21天）：

该模型本身为纯细胞系，缺乏在小肠上皮细胞中的黏液层；缺少细胞培养标准以及试验操作标准，使结果有时缺乏可比性；由于Caco-2细胞来源于人结肠，因而该细胞的转运特性、酶的表达以及跨膜电阻相对更能反映结肠细胞而非小肠细胞。

二、基于P-gp药物吸收体外转运载体模型

在肠上皮细胞上还存在一种特殊的转运分子P-gp，它定位于胃肠道细胞的膜表面。

凡是能被P-gp识别作为底物的药物在通过其他途径进入细胞后，还会被P-gp通过一个耗能的过程挤压出细胞。

因此，转运载体（如P-gp）在药物的吸收转运中扮演了重要的角色。

由于分子生物学技术的迅速发展，使可以在体外进行转运载体分子的异种表达并在体外用于药物的转运的研究。

目前已经建立的Caco-2和L-MDR1模型可以在体外表达P-gp，这些模型适合于体外转运的高通量筛选，如用于由P-gp导致的口服生物利用度降低或改变的药物高通量鉴别。

此外，可采用稳定的细胞株在体外表达高水平的摄取转运载体，如有机阴离子转运蛋白（OATP），现已经可以使用克隆和细胞转染技术在体外表达制备并用于有机阴离子转运研究。

膜囊泡和分离的肝实质细胞技术也可用于高通量筛选。

第二节药物体内分布特征预测研究

药物被吸收进入血液循环后，会与血浆蛋白结合，而非结合的游离型则通过生物膜移行至各组织，而后与药物作用部位发生反应，显示其药效。

药物与血浆蛋白和不同组织蛋白的结合能力以及各个组织细胞膜对药物的转运能力都影响分布过程。

药物在某个组织中的富集可以被用来靶向给药，也可能会导致组织中毒。

一、药物与血清蛋白结合模型

药物在血流中转运时，一部分是以游离溶解于血液中，另一部分则与血液的多种成分（如血浆蛋白和血细胞）相结合。

决定血浆中结合药物与非结合药物比率的主要因素是药物分子和蛋白质分子间的可逆性相互作用。

多种血浆蛋白能与药物相结合，如白蛋白、α1-酸性糖蛋白和脂蛋白是重要的蛋白质。

酸性药物易与白蛋白结合，而碱性蛋白则易与α1-酸性糖蛋白和脂蛋白结合。

目前用于药物与血清蛋白研究的体外方法主要有：

平衡透析、超滤、凝胶过滤、光谱法和光学生物传感器。

平衡透析、超滤和凝胶过滤的特点是，将与蛋白结合的药物与未结合的药物分开，从而便于衡量药物与蛋白的结合率。

通常药物是小分子，而蛋白是大分子，平衡透析法采用半透膜将药物和蛋白分在两个小室内，只有小分子可以透膜，达到平衡后测量两室内药物的浓度；超滤法采用超滤膜，将离心管隔开，药物与蛋白混合液加在上室内开始离心，蛋白分子不能透膜，与蛋白结合的药物分子也不会被离心到下室，只有游离的药物分子能进入下室；凝胶过滤是通过凝胶渗透层析将蛋白与小分子药物分离开。

光谱法是通过蛋白与药物结合后的光吸收改变来测定与蛋白结合的药物的量，这种方法只在特殊的情况下才能使用。

光学生物传感器使用表面等离子体共振技术，主要用于探测生物分子间的相互作用，因而可用于药物开发的许多过程中。

该技术可筛选针对某一靶位点的先导化合物，也可检测药物与蛋白包括酶的结合能力。

二、药物向各组织分布的模型

目前在这方面没有有效的体外模型，比较类似的是考虑各组织的生物膜组分不同，建立相应的人造生物膜，用于分析药物在血液与人造生物膜的分布系数，从而衡量药物向组织分布的能力。

但由于生物膜上的蛋白受体不可能很好的模拟，这样的结果可信度并不高。

这主要用于建立数据分析药物的理化性质参数与分布之间的关系。

三、透血-脑脊液屏障模型

在所有组织中，脑组织比较特殊，脑循环毛细血管内皮细胞相互接触紧密，并有重叠，而且毛细血管还被神经胶质细胞所包裹，构成血-