第十六章放射性核素在分子生物学研究中的应用.docx
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第十六章放射性核素在分子生物学研究中的应用
第十六章放射性核素在分子生物学研究中的应用
第一节概述
分子生物学是研究生物大分子的结构与功能的一门学科。
自从1953年Watson与Crick提出DNA分子的双螺旋结构模型以来，基因的分子生物学迅猛发展，并于20世纪70年代建立了基因工程技术。
这项技术与DNA序列分析技术的不断发展和完善，使人们得以在分子水平来揭示生命现象的本质，并且促进了工农业和医学的发展，成为新技术革命的重要支柱，20世纪被称为生命科学的世纪,生命科学的发展成果已经影响到人们生活的各个方面,并正在改变着社会的未来。
随着人类基因组计划的完成和其他生物和植物基因组计划的开展与完成，有关蛋白功能的研究更加引起人们的关心。
在这方面的研究中，同位素技术仍然发挥着巨大的作用。
在分子生物学的发展过程中，放射性核素示踪技术起到了十分重要的作用。
早在1952年，Hershey就利用32P标记的磷酸和35S标记的氨基酸作示踪剂，培养产生含32P标记DNA和35S标记外壳蛋白质的噬菌体，然后用这种标记噬菌体感染未标记的大肠杆菌，发现在细菌内复制产生的子代病毒中含有大量32P，而不含35S，从而证实，病毒遗传信息携带者是大分子DNA而非蛋白质。
Meselson和Stahl用15NH4Cl培养基培养大肠杆菌，再利用超速离心方法证实，大肠杆菌繁殖过程中，子代细菌中DNA双螺旋分子的一条链是由亲代直接而来，另一条链是新合成的，DNA复制具有半保留特性。
mRNA的首次分离及mRNA信息来自DNA也是应用同位素标记技术证实的。
值得一提的是Nirenberg等的实验，他们首先人工合成由A、U、G、C中1～3种随机组成的多种三核苷酸，然后获得20种14C或3H标记的和非标记的氨酰基-tRNA。
这样，在含有一个核糖体、所需研究的三核苷酸和14C或3H标记的20种氨酰基-tRNA中的某一种及其他19种非标记氨酰基-tRNA所组成的反应系统中，可以寻找出某种氨基酸与某种三核苷酸之间的对应关系，以三核苷酸代表mRNA上的一个密码，即可以确定大部分三核苷酸密码子的意义。
核酸序列分析和核酸分子杂交中最常用的示踪手段是放射性核素示踪，尽管PCR技术的发展，可以用其他标记物作为研究手段，但同位素仍然有其不可替代性。
第二节核酸标记技术
核酸结构分析研究中，常用放射性核素示踪技术；1975年以前，常用的放射性核素是3H和14C，而其后，32P标记物得到了广泛的应用，使得核苷酸顺序分析趋于微量化与简便化。
35S也是常用的放射性核素之一，尽管S并非核苷酸中所含核素，但它与氧元素同属一族，常可用来代替氧原子。
20实世纪90年代开始应用新型放射性核素33P。
表16-1是几种核素之间的物理特性比较。
32P射线较强，容易检测；但辐射危害较大，半衰期较短，使用期较短，更主要的是电泳自显影条带有一些扩散，影响分辨率。
而35S射线较弱，电泳后放射性自显影条带细窄而又清晰，分辨率高；但在自显影前必需先用酸固定凝胶，洗去变性剂尿素，再抽干凝胶。
33P有其优越性，它的能量和半衰期居中，因而在制备高比活度的标记化合物时，无需特殊保护设备，使用也安全。
由于它的能量比32P弱，相当于32P的1／5；尽管半衰期比32P约长一倍，但比35S短，因而在放射性自显影时，曝光时间适中，并且无需事先抽干凝胶，方便易行。
此外125I也是常用的放射性核素。
应用时可以根据需要和可能，选用适当的放射性核素。
表16-l几种放射性核素物理性质比较
32P
33P
35S
射线
β—
β—
β—
半衰期（d）
14
25
87
最大能量（MeV）
1.7
0.25
0.17
条带分辨率
扩散
较好
清晰
操作
不需固定
不需抽干胶
需抽干胶、洗尿素
结论
较好
最好
可以
一、高放射性比活度的［γ-32P］ATP与［α－32P］dNTP的制备
［γ-32P］ATP与［α-32P］dNTP是32P标记核酸的最重要的化合物，图16-1是ATP分子结构示意图。
α
β
γ
图16-1ATP分子结构示意图
标记时是把三磷酸核苷分子中α或γ位置上的P原子用32P替换下来。
为了获得高放射性比活度化合物，常利用酶促反应并加上无载体32P来合成［γ-32P］ATP。
反应式如图16-2所示。
图16-2［γ-32P］ATP合成反应式
这是利用生物体内糖代谢的反应来合成所需要的［γ-32P］ATP。
其中第1步为不可逆反应，而第2步是可逆反应，如果在反应体系中加入过量ATP，将使反应逆转，而得不到所需产物。
此反应一般在半小时内即可完成，用EDTA终止反应。
为了提高放射性比活度，目前对这一反应体系作了一定的修改，即不用氧化染料，而以丙酮酸及乳酸脱氢酶反应代替，以便维持较高浓度的NAD+；同时，改用L-α-甘油磷酸为起始底物，并在反应体系中加入L-α-甘油磷酸脱氢酶和三糖磷酸异构酶，生成中间产物D-甘油醛-3-磷酸，此化合物在水中不易水解，从而提高了［γ-32P］ATP比活度。
一般来说，此标记方法在各实验室中均可进行，因为反应试剂较简单，所用的酶又可从兔肌肉中获得，而无载体32P也可以商业供应。
当然,也有商品供应的［γ-32P］ATP。
［γ-32P］ATP经过酶促反应，可以用来合成[α-32P]ATP或其他的［α-32P］dNTP。
即利用多核苷酸激酶促使［γ-32P］dNTP与NP3或dNP3＇（N为A，G，C，T）反应，使dNP3＇在5＇端加上32P而形成32PdNP3＇，再用核酸水解酶P1水解3＇-磷酸，使32PdNP3＇变成32PdN，然后用肌激酶和丙酮酸激酶使之磷酸化，生成PP32PdN即［α-32P］dNTP,见图16-3。
反应结束后用离子交换树脂纯化获得[α-32P]dNTP。
通过上述反应，所获得的［γ-32P］ATP的比活度可达到7.4×1013Bq／mmol，［α-32P］dNTP可达3.7×1013Bq／mmol，符合核酸序列分析和进行探针制备用于核酸分子杂交的要求。
[γ-32P]ATP+Np3＇或[γ-32P]ATP+dNP3＇（N:
A、G、C、T）
↓（多核苷酸激酶）
32PNP3＇
或32PdNP3＇（5＇端为32P）
↓（核酸水解酶P1）
32PN或32PdN
↓（肌酸激酶，丙酮酸激酶）
pp32PN[α-32P-NTP]或pp32PdN[α-32P-dNTP]
图16-3[α-32P-NTP]或[α-32P-dNTP]合成示意图
二、35S标记核苷酸
如本节前所述，35S标记物也有其优点，与32P相比，其自显影图像清晰，容易分辨。
因为硫元素在核苷酸中并不存在，但它与氧元素同属一族；因此，将核苷酸分子中α位的磷酸上一个氧原子用硫原子代替，就可以得到相应的硫代核苷酸类似物，其化学性质和生物活性基本不变。
如应用［α-35S］dATPαs进行标记的末端终止法测序，效果较好。
目前还有商品供应的［α-35S］dCTPαs，用来做核酸分子杂交的探针。
三、125I标记核酸
核酸（包括DNA和RNA）在三氯化铊（TlCl3）存在下加热，125I与胞嘧啶环上5位碳原子形成稳定共价键，胞嘧啶变成5-125I-胞嘧啶，这个化合物很稳定。
用SephadexG-50层析柱分离，可以获得纯化的碘标记核酸。
因为此法标记核酸较简便，而不影响核酸生物活性，125I又容易探测，因此作一简要介绍。
四、核酸的酶法标记
相对于早期的化学标记法，核酸的酶标法是一个革命性的进步，它具有以下特点：
①操作方便快捷；②酶法标记对核苷酸分子基因没有任何化学修饰作用，因而它不会改变核酸分子链的化学组成和生化性质；③由于酶的催化反应的特异性，决定了其标记位置具有高度特异性，便于人工控制；④标记产物放射性比活度高，因而可以大大提高生物样品检测时的灵敏度，这也是它的最大优点。
核酸的酶标记法很多，可以是DNA或RNA全链标记，也可以是DNA或RNA分子的末端标记；末端标记又可分为3＇末端和5＇末端标记法两种,见表16-2。
下面就各种方法的原理、所用的酶、底物及主要步骤作逐个介绍。
表16-2核酸的酶法标记
标记位置
标记方法
DNA标记
RNA标记
全链标记
切口平移法（DNA聚合酶Ⅰ）
SP6RNA聚合酶
随机寡核苷酸引导的cDNA标记（Klenow酶）
T7RNA聚合酶
通用引物指导的cDNA标记（Klenow酶）
大肠杆菌RNA聚合酶
与单链RNA互补的DNA标记（逆转录酶）
PCR
3＇末端标记
Klenow酶催化的双链DNA3＇末端标记（Klenow酶）
T4RNA连接酶催化的RNA3＇末端标记
噬菌体T4DNA聚合酶催化的双链DNA3＇末端标记（噬菌体T4DNA聚合酶）
末端转移酶催化的3＇末端标记（末端转移酶）
5＇末端标记
噬菌体T4多核苷酸激酶催化的DNA5＇末端标记（T4多核苷酸激酶）
T4多核苷酸激酶催化的5＇末端标记
突变了的无3＇磷酸酶活性的T4多核苷酸激酶催化的5＇末端标记
（一）DNA全链标记
DNA全链标记是在整条DNA链上都有放射性核素原子掺入，因而放射性比活度高，常用来制备DNA分子探针，根据所用酶的不同，又分为以下几种方法：
1．切口平移法
切口平移法（nicktranslation）的原理是：
待标记的DNA分子中的一条链在镁离子存在的情况下，在少量大肠杆菌DNA酶I（DNaseI）的作用下，被切出若干个缺口（nick）从而暴露出3＇-OH端，然后在大肠杆菌DNA聚合酶I的5＇→3＇方向外切功能作用下，这个缺口3＇方向的核苷酸逐个被切下；而同时，反应体系中的4种dNTP（其中包括最少1种[α-32P]dNTP）在大肠杆菌DNA聚合酶I的5＇→3＇方向聚合功能作用下，以另一条DNA链为模板，按碱基互补原则填补缺口并逐一向3＇方向平移（translation）。
因此，放射性标记前体[α-32P]dNTP不断掺入DNA链，且DNA序列没有改变。
最终得到标记上32P的全链DNA。
本法的关键是大肠杆菌DNA聚合酶I所具有的双重功能。
经过此法标记的DNA，在经过变性与复性后，DNA单链的长度变短。
一般而言，加入的DNaseI量过大时，所获得的探针片段偏小。
切口平移法除用32P标记的dNTP外，也可以用3H、14C标记的dNTP或125I标记的dCTP。
图16-4是用切口平移法标记全链DNA的示意图，通过此法获得的DNA探针的放射性比活度可达4×1O9～4×1O11Bq／μg。
图16-4切口平移法（DNA聚合酶Ⅰ）DNA全链标记
2.随机寡核苷酸引导的cDNA标记
此法是使用人工合成的各种碱基组合的寡核苷酸（长度一般6～12个核苷酸），将它们与单链DNA模板混合，其中必定有可与模板DNA杂交的片段，此片段即可起引物作用；使用[α-32P]dNTP作前体，在DNA聚合酶作用下，合成DNA探针,见图16-5。
合成时一般使用1种标记dNTP和3种非标记dNTP作前体；所使用的酶是大肠杆菌DNA聚合酶I经过枯草杆菌蛋白酶处理后形成的Klenow片段，它保留有5＇→3＇聚合酶活性和3＇→5＇外切酶活性,见图16-6。
所用的寡核苷酸一般有商品供应。
用此法获得的DNA探针的放射性比活度可达3×1O9～4×1O10Bq／μg。
图16-5随机寡核苷酸引导的cDNA全链标记
图16-5Klenow酶生成示意图
3.通用引物指导的cDNA标记
噬菌体M13以单链环状形式存在，在它的DNA序列中有一称为多克隆位点的片段，在此片段上有一系列限制性内切酶切点，外源性的DNA可以插入该区域，临近多克隆位点的3＇端存在一个LacZ基因区，制备与该基因上一小段DNA互补的片段作为引物（即通用引物），在Klenow酶作用下，以插入的外源性DNA（即感兴趣序列）为模板，以1种［α-32P］dNTP和3种非标记dNTP为前体，从通用引物的3＇端开始合成cDNA,见图16-7。
合成过程结束后使用限制性内切酶消化，并用凝胶电泳方法分离并获得标记的DNA片段。
图16-7在M13重组DNA上制备标记DNA
4.与单链RNA互补的DNA标记
合成与mRNA互补的DNA通常使用两种引物，如果所用mRNA模板3＇端具有PolyA结构，就可以用人工合成的寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸（Oligo-dT）作为引物；如果没有PolyA结构，则要使用随机引物。
使用前一种引物的缺点是所得到的探针可能含有一段不需要的DNA序列。
在逆转录酶作用下，以1种[α-32P]dNTP和3种非标记的dNTP作前体，以mRNA为模板，合成得到标记的cDNA,见图16-8。
图16-8与单链RNA互补的DNA全链标记
为了获得对感兴趣mRNA的高度放射性比活度的cDNA探针，通常在标记时加大mRNA模板用量，或是富集感兴趣的mRNA序列作为模板。
如果所得到的探针是用于筛选cDNA文库，那么感兴趣片段所标记到的放射性核素必须大于106Bq。
值得注意的是获得的高比活度探针很容易因为辐射裂解而损伤破坏，因此探针制备后应立即使用。
（二）RNA全链标记
合成高放射性比活度的单链RNA探针需要经过改造的含有多克隆位点的质粒载体；所用的酶有两种：
一种是SP6RNA聚合酶，它是SP6编码的以DNA为模板的RNA聚合酶，具有极强的启动子特异性，即只能特异性地转录SP6启动子下游的DNA；另一种是T7和T3RNA聚合酶，同样它也有启动子特异性，只能特异性地转录噬菌体T7和T3启动子下游的DNA。
如果在质粒的多克隆位点插入一条所需检测的DNA序列片段，此时，将启动子（如SP6启动子或T7启动子）插入质粒的多克隆位点的上游，这样在相应的RNA聚合酶作用下，以插入的靶DNA为模板，转录合成RNA。
如果所用的4种rNTP底物中有1种是［α-32P］rNTP，就可以得到与靶DNA片段互补的具有高比活度的标记RNA。
用本法制备RNA探针具有其优越性：
首先，用此法标记RNA的效率远远高于单链DNA探针制备法，因为合成RNA的DNA模板可以被转录多次，RNA的产量可以数倍于模板DNA的量。
其次，用此法制备高比活度的RNA探针相对价格便宜，因为RNA聚合酶功能在底物低达l～20μmol时，仍然保持其活性。
第三，RNA探针无须经过凝胶电泳高度纯化。
第四，用此法制备的RNA探针在杂交时具有较高的敏感性，一般要比大小和比活度相同的DNA探针敏感2～10倍。
RNA的全链标记，还可以用大肠杆菌RNA聚合酶非特异性地把靶DNA转录成RNA，获得放射性比活度1010Bq／μg的32P标记RNA。
（三）DNA末端标记法
DNA分子的末端可以在适当的酶作用下，标记上放射性核素。
此法常用于限制性内切酶图谱分析、化学法DNA序列分析。
下面作一简要介绍。
1．Klenow酶催化的双链DNA3＇末端标记
此法相似于引物指导的cDNA合成，要求待标记的双链DNA-端的5＇末端突出，而相应的3＇末端缩进，并含有羟基结构。
在反应体系中加入Klenow酶，并加入1种［α-32P］dNTP，加入的这种标记dNTP，由5＇突出末端的序列决定（根据碱基配对原则）。
如果没有这种粘性末端，则经过某种限制性内切酶切割所需要的末端。
如选用EcoRI切割产生粘性末端，就可以在反应体系中加入标记的dATP或dTTP，在3＇末端标上32P。
见下面两式：
如果我们选用限制性内切酶BamHI切割产生相应的粘性末端，则可以在反应体系中加入[α-32P]dGTP，从而在3＇末端标上32P，见下式。
而对于钝性末端的标记，则需要通过在3＇-OH末端进行核苷酸置换反应，来标记上32P。
见下式。
标记反应可以在用DNA限制性内切酶消化后立即进行，而不必去除限制性内切酶，因为Klenow酶工作条件要求低，适应性强。
当标记产物是用于Maxam-Gilbert法进行DNA序列分析时，加入到反应体系中的标记dNTP应当达到最大量，反应过后还需加入适量的4种未标记的dNTP，以便使得到的标记DNA分子一样长。
2.噬菌体T4DNA聚合酶催化的双链DNA3＇末端标记
T4DNA聚合酶与Klenow酶一样，可以用来标记具有3＇粘性末端的DNA分子。
但是T4DNA聚合酶具有极强的3＇→5＇外切酶活性，因而常用来标记3＇末端突出的双链DNA分子。
见下式:
在使用DNA限制性内切酶消化DNA分子后，限制性内切酶要从反应系统中去除，然后再进行末端标记。
3.末端转移酶催化的3＇末端标记末端转移酶可以催化DNA分子3＇-OH端接上。
α-32P标记的同源多聚核苷酸，其中α-32P标记的核苷酸的数量可以从1个到数十个。
被催化的DNA分子既可以是单链，也可以是双链。
4.噬菌体T4多核苷酸激酶催化的DNA5＇末端标记
噬菌体T4多核苷酸激酶催化DNA5＇末端的32P标记有两条途径，一为正向反应（forwardreaction），即DNA5＇末端的磷酸被碱性磷酸激酶催化而失去，形成DNA的5＇－OH末端，然后，经过T4多核苷酸激酶作用，将[γ-32P]dATP中的32P连接到DNA5＇－OH末端上形成5＇末端标记的DNA分子。
见下式:
另一条途径是交换反应（exchangereaction），即DNA5＇末端的磷酸在T4多核苷酸激酶作用下转移到外来的ADP分子上；然后仍在T4多核苷酸激酶作用下，将［γ-32P］dATP中γ-32P转移到DNA5＇末端，形成5＇末端标记的DNA分子。
见下式:
（四）RNA末端标记
1．T4多核苷酸激酶催化的5＇末端标记
T4多核苷酸激酶（T4PNK）同样可以催化ATP分子中γ-P转移到RNA5＇-OH末端。
但是因为T4PNK还具有3＇磷酸酶活性，将使3＇末端为磷酸的RNA变性，故标记时选用一种突变了的无3＇磷酸酶活性的T4多核苷酸激酶，催化[γ-32P]ATP中的γ-32P标记到RNA5＇末端，而又不影响RNA活性。
2．T4RNA连接酶催化的RNA3＇末端标记
T4RNA连接酶可以将放射性前体5＇32PCp连接到RNA3＇-OH末端上；此标记技术在RNA指纹图谱实验和序列分析研究中非常有用。
以上逐一介绍了各种放射性核素核酸标记技术，根据使用标记核酸的目的不同，可以选用不同的方法。
核酸的放射性标记技术已经成为核酸序列分析技术、核酸分子杂交技术和基因工程技术的重要组成部分。
放射性核素在分子生物学发展中起到了极其重要的作用，并仍然发挥其特殊的作用；它的高度灵敏性仍然是其他标记示踪物所无法超越的。
但它也有缺陷，如半衰期短，有放射性危害，操作麻烦，时间长。
因而，近年来人们发明了许多非放射性标记物。
如用荧光素代替放射性核素；采用夹心法，在核酸上标记生物素，再利用生物素-亲和素-酶联结催化底物产生化学发光来代替放射性核素的自显影，这种化学发光法灵敏度极高，可以快速操作，这是未来发展的方向之一。
第三节放射性核素在核酸序列分析中的应用
核酸序列分析是分子生物学研究中最重要的技术之一。
它的目的在于测定出核酸（DNA和RNA）的核苷酸排列顺序。
它又分为DNA序列分析和RNA序列分析。
由于DNA序列分析技术的建立，人们对DNA的认识深入到了核苷酸水平，对基因结构与功能的研究起着十分重要的作用，也为一些分子病的发病机制和基因治疗研究提供了依据。
目前，DNA序列分析方法有许多种，如化学切割法、加减法、末端终止法、连续测定法、M13克隆载体法、热循环测序、固相测序等。
尽管方法不同，但有两点是共同的，首先是这些方法都使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，因为它具有极强的分辨率，即使两分子只相差一个核苷酸，也能在凝胶上形成两条分开的带；其次，这些方法都需要经过不同的处理，得到一系列长度只相差一个核苷酸的单链DNA分子。
一般DNA序列分析时，所要分析的DNA分子不能太大，长度在400b左右的分子较理想。
目前,由于技术的进步和分析仪器的发展与成熟,在分子生物学实验室尤其是一些国家实验室,都可以进行快速和高通量的测序分析，如用基因芯片技术。
下面介绍几种常用的DNA序列分析技术：
一、化学切割法DNA序列分析
此法可以对双链DNA进行序列分析，也可以分析单链DNA。
首先要对待测的DNA片段进行末端标记（3＇或5＇），标记方法如本章第二节所述；然后用变性拆链的方法，将双链DNA在30％二甲基亚砜（DMSO）中热变性，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳拆链的方法，将DNA双链分开成两条单链；或者用酶切方法将标记过的DNA切成两段，这样就得到了只有一端（3＇或5＇端）标记过的样品。
将样品分别同时进行4种修饰与切割反应，它们是G，G十A，C和C十T。
一般使用硫酸二甲酯使A和G两种嘌呤甲基化，用肼使C和T两种嘧啶变为腙，然后使用试剂将修饰过的碱基切掉。
例如，在G反应中，所有的G都有可能被切割掉，但就某一个（或一些）分子来说，只有某一个或某几个G被切割掉；因而在G反应中存在不同位置上的G被切割的、从标记的一端算起具有各种长度的DNA分子，同理，其他3个反应也如此。
将经化学切断的样品变性，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，样品在凝胶上的迁移率按片段所含核苷酸的多少自下而上排列。
电泳后作放射自显影，同样自下而上读每一条带，得到DNA序列。
应当注意在C和C＋T两个反应中，同时出现的带应读为C，只在C＋T中出现的带读作T，同样，在G和G十A反应中，同时出现的带读作G，只在G＋A中出现的带读为A。
本法实验要求不高，试剂容易购得，但目前尚无特异性较高的切断A或T的反应，所以这两个碱基不易直观显示出来。
二、双脱氧核苷酸链终止法作DNA序列分析
它的基本原理是：
在引物存在下，利用Klenow酶5＇→3＇的聚合酶活性在单链DNA模板上合成互补链，如果反应体系中加入ddNTP（即2＇，3＇-双脱氧核糖核苷三磷酸），它同样可在酶作用下掺入新合成的链，但因为ddNTP3＇位置上没有羟基，这条链合成到此终止。
实验时，首先将欲检测的单链DNA模板接上引物，然后将样品分成4组，每组中含Klenow酶，4种dNTP（其中1种是［α-32P］dNTP），4种ddNTP中的一种。
以加ddATP为例，当遇到模板碱基为T时，反应系统中ddATP和dATP都可掺入新链，前者掺入时则链合成终止，后者掺入时，则继续进行链的合成。
ddATP掺入是随机的，因此可以得到一系列不同长度的以ddATP为末端的DNA片段。
其余3组反应以此类推。
把4组反应综合起来，我们就可以得到长度只相差一个核苷酸的一整套DNA分子，将反应得到的DNA变性后电泳，并用凝胶直接作放射自显影，就可以得到自显影带，而每一条带都代表一定长度的单链DNA分子，由低向高逐条解读就可以得到DNA序列。
值得注意的是这个解读出来的序列不是所需分析的那条DNA链的序列，而是其互补链的序列。
三、M13载体-链终止法作DNA序列分析
当要分析某一较长的DNA序列时，必须要作出详细的酶切图谱，并把DNA切成长度为300b左右的短片段，再克隆到M13载体中去，经过转化得到重组克隆，将这些克隆进行悬液培养，从菌体中提取RF型DNA，通过酶切和电泳，确定各个克隆中所含的外源DNA片段，从上清液中提取单链DNA用于序列分析。
这一过程称为单链DNA制备。
在M13克隆载体中，在克隆部位的3＇端有一长度为17b的特殊序列，使用人工合成的一段互补寡核苷酸与之退火，即成为Klenow酶合成反应的引物。
然后用链末
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