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1、第十六章放射性核素在分子生物学研究中的应用第十六章 放射性核素在分子生物学研究中的应用第一节 概述 分子生物学是研究生物大分子的结构与功能的一门学科。自从1953年Watson与Crick提出 DNA分子的双螺旋结构模型以来，基因的分子生物学迅猛发展，并于20世纪7 0年代建立了基因工程技术。这项技术与DNA序列分析技术的不断发展和完善，使人们得以在分子水平来揭示生命现象的本质，并且促进了工农业和医学的发展，成为新技术革命的重要支柱，20世纪被称为生命科学的世纪,生命科学的发展成果已经影响到人们生活的各个方面, 并正在改变着社会的未来。随着人类基因组计划的完成和其他生物和植物基因组计划的开展与

2、完成，有关蛋白功能的研究更加引起人们的关心。在这方面的研究中，同位素技术仍然发挥着巨大的作用。在分子生物学的发展过程中，放射性核素示踪技术起到了十分重要的作用。早在1952年，Hershey就利用32P标记的磷酸和35S标记的氨基酸作示踪剂，培养产生含32P标记DNA和35S标记外壳蛋白质的噬菌体，然后用这种标记噬菌体感染未标记的大肠杆菌，发现在细菌内复制产生的子代病毒中含有大量32P，而不含35S，从而证实，病毒遗传信息携带者是大分子DNA而非蛋白质。Meselson和Stahl用15NH4Cl培养基培养大肠杆菌，再利用超速离心方法证实，大肠杆菌繁殖过程中，子代细菌中DNA双螺旋分子的一条链

3、是由亲代直接而来，另一条链是新合成的，DNA复制具有半保留特性。mRNA的首次分离及mRNA信息来自DNA也是应用同位素标记技术证实的。值得一提的是Nirenberg等的实验，他们首先人工合成由A、U、G、C中13种随机组成的多种三核苷酸，然后获得20种14C或3H标记的和非标记的氨酰基-tRNA。这样，在含有一个核糖体、所需研究的三核苷酸和14C或3H标记的20种氨酰基-tRNA中的某一种及其他19种非标记氨酰基-tRNA所组成的反应系统中，可以寻找出某种氨基酸与某种三核苷酸之间的对应关系，以三核苷酸代表mRNA上的一个密码，即可以确定大部分三核苷酸密码子的意义。核酸序列分析和核酸分子杂交中

4、最常用的示踪手段是放射性核素示踪，尽管PCR技术的发展，可以用其他标记物作为研究手段，但同位素仍然有其不可替代性。第二节 核酸标记技术核酸结构分析研究中，常用放射性核素示踪技术；1975年以前，常用的放射性核素是3H和14C，而其后，32P标记物得到了广泛的应用，使得核苷酸顺序分析趋于微量化与简便化。35S也是常用的放射性核素之一，尽管S并非核苷酸中所含核素，但它与氧元素同属一族，常可用来代替氧原子。20实世纪90年代开始应用新型放射性核素33P。表16-1是几种核素之间的物理特性比较。 32P射线较强，容易检测；但辐射危害较大，半衰期较短，使用期较短，更主要的是电泳自显影条带有一些扩散，影响

5、分辨率。而35S射线较弱，电泳后放射性自显影条带细窄而又清晰，分辨率高；但在自显影前必需先用酸固定凝胶，洗去变性剂尿素，再抽干凝胶。33P有其优越性，它的能量和半衰期居中，因而在制备高比活度的标记化合物时，无需特殊保护设备，使用也安全。由于它的能量比32P弱，相当于32P的15；尽管半衰期比32P约长一倍，但比35S短，因而在放射性自显影时，曝光时间适中，并且无需事先抽干凝胶，方便易行。此外125I也是常用的放射性核素。应用时可以根据需要和可能，选用适当的放射性核素。表16-l 几种放射性核素物理性质比较32P33P35S射线半衰期（d）142587最大能量（MeV）1.70.250.17条带

6、分辨率扩散较好清晰操作不需固定不需抽干胶需抽干胶、洗尿素结论较好最好可以一、高放射性比活度的-32PATP与32PdNTP的制备-32PATP与-32PdNTP是32P标记核酸的最重要的化合物，图16-1是ATP分子结构示意图。图16-1 ATP分子结构示意图标记时是把三磷酸核苷分子中或位置上的P原子用32P替换下来。为了获得高放射性比活度化合物，常利用酶促反应并加上无载体32P来合成-32PATP。反应式如图16-2所示。 图16-2 -32PATP合成反应式这是利用生物体内糖代谢的反应来合成所需要的-32PATP。其中第1步为不可逆反应，而第2步是可逆反应，如果在反应体系中加入过量ATP，

7、将使反应逆转，而得不到所需产物。此反应一般在半小时内即可完成，用EDTA终止反应。为了提高放射性比活度，目前对这一反应体系作了一定的修改，即不用氧化染料，而以丙酮酸及乳酸脱氢酶反应代替，以便维持较高浓度的NAD+；同时，改用L-甘油磷酸为起始底物，并在反应体系中加入L-甘油磷酸脱氢酶和三糖磷酸异构酶，生成中间产物D-甘油醛-3-磷酸，此化合物在水中不易水解，从而提高了-32PATP比活度。一般来说，此标记方法在各实验室中均可进行，因为反应试剂较简单，所用的酶又可从兔肌肉中获得，而无载体32P也可以商业供应。当然,也有商品供应的-32PATP。-32PATP经过酶促反应，可以用来合成-32PAT

8、P或其他的-32PdNTP。即利用多核苷酸激酶促使-32PdNTP与NP3或dNP3（N为A，G，C，T）反应，使dNP3在5端加上32P而形成32P dNP3，再用核酸水解酶P1水解3-磷酸，使32PdNP3变成32PdN，然后用肌激酶和丙酮酸激酶使之磷酸化，生成PP32PdN即-32PdNTP, 见图16-3。反应结束后用离子交换树脂纯化获得-32PdNTP。通过上述反应，所获得的-32PATP的比活度可达到7.41013 Bqmmol，-32PdNTP可达3.710 13 Bqmmol，符合核酸序列分析和进行探针制备用于核酸分子杂交的要求。-32PATP + Np3 或-32 PATP

9、+dNP3 ( N:A、G、C、T) ( 多核苷酸激酶)32PNP3 或 32PdNP3 (5端为32P) (核酸水解酶P1) 32PN 或 32PdN (肌酸激酶，丙酮酸激酶) pp32PN -32P-NTP 或 pp32PdN -32P-dNTP图16-3 -32P-NTP或-32P-dNTP合成示意图二、35S标记核苷酸如本节前所述，35S标记物也有其优点，与32P相比，其自显影图像清晰，容易分辨。因为硫元素在核苷酸中并不存在，但它与氧元素同属一族；因此，将核苷酸分子中位的磷酸上一个氧原子用硫原子代替，就可以得到相应的硫代核苷酸类似物，其化学性质和生物活性基本不变。如应用-35SdATP

10、s进行标记的末端终止法测序，效果较好。目前还有商品供应的-35SdCTPs，用来做核酸分子杂交的探针。三、125I标记核酸核酸（包括DNA和RNA）在三氯化铊（TlCl3）存在下加热，125I与胞嘧啶环上5位碳原子形成稳定共价键，胞嘧啶变成 5-125I-胞嘧啶，这个化合物很稳定。用Sephadex G-50层析柱分离，可以获得纯化的碘标记核酸。因为此法标记核酸较简便，而不影响核酸生物活性，125I又容易探测，因此作一简要介绍。四、核酸的酶法标记相对于早期的化学标记法，核酸的酶标法是一个革命性的进步，它具有以下特点：操作方便快捷；酶法标记对核苷酸分子基因没有任何化学修饰作用，因而它不会改变核酸

11、分子链的化学组成和生化性质；由于酶的催化反应的特异性，决定了其标记位置具有高度特异性，便于人工控制；标记产物放射性比活度高，因而可以大大提高生物样品检测时的灵敏度，这也是它的最大优点。核酸的酶标记法很多，可以是DNA或RNA全链标记，也可以是DNA或RNA分子的末端标记；末端标记又可分为3末端和5末端标记法两种,见表16-2。下面就各种方法的原理、所用的酶、底物及主要步骤作逐个介绍。表16-2 核酸的酶法标记标记位置标记方法DNA标记RNA标记全链标记切口平移法 (DNA聚合酶)SP6 RNA聚合酶随机寡核苷酸引导的cDNA标记(Klenow酶)T7 RNA聚合酶通用引物指导的cDNA标记(K

12、lenow酶)大肠杆菌RNA聚合酶与单链RNA互补的DNA标记(逆转录酶)PCR3末端标记Klenow酶催化的双链DNA 3末端标记(Klenow酶)T4 RNA连接酶催化的RNA 3末端标记噬菌体T4 DNA聚合酶催化的双链DNA 3末端标记(噬菌体T4 DNA聚合酶)末端转移酶催化的3末端标记(末端转移酶)5末端标记噬菌体T4多核苷酸激酶催化的DNA 5末端标记(T4多核苷酸激酶)T4多核苷酸激酶催化的5末端标记突变了的无3磷酸酶活性的T4多核苷酸激酶催化的5末端标记（一） DNA全链标记DNA全链标记是在整条DNA链上都有放射性核素原子掺入，因而放射性比活度高，常用来制备DNA分子探针，

13、根据所用酶的不同，又分为以下几种方法：1切口平移法切口平移法（nick translation）的原理是：待标记的DNA分子中的一条链在镁离子存在的情况下，在少量大肠杆菌 DNA酶I（DNase I）的作用下，被切出若干个缺口（nick）从而暴露出 3-OH端，然后在大肠杆菌DNA聚合酶I的53方向外切功能作用下，这个缺口3方向的核苷酸逐个被切下；而同时，反应体系中的4种dNTP（其中包括最少1种-32PdNTP）在大肠杆菌DNA聚合酶I的53方向聚合功能作用下，以另一条DNA链为模板，按碱基互补原则填补缺口并逐一向3方向平移（translation）。因此，放射性标记前体-32PdNTP不断

14、掺入DNA链，且DNA序列没有改变。最终得到标记上32P的全链DNA。本法的关键是大肠杆菌DNA聚合酶I所具有的双重功能。经过此法标记的DNA，在经过变性与复性后，DNA单链的长度变短。一般而言，加入的DNase I量过大时，所获得的探针片段偏小。切口平移法除用32P标记的dNTP外，也可以用3H、14C标记的dNTP或125I标记的dCTP。图16-4是用切口平移法标记全链DNA的示意图，通过此法获得的DNA探针的放射性比活度可达41O941O11 Bqg。 图16-4切口平移法 (DNA聚合酶) DNA全链标记2.随机寡核苷酸引导的cDNA标记 此法是使用人工合成的各种碱基组合的寡核苷酸（

15、长度一般612个核苷酸），将它们与单链DNA模板混合，其中必定有可与模板DNA杂交的片段，此片段即可起引物作用；使用-32PdNTP作前体，在 DNA聚合酶作用下，合成DNA探针,见图16-5。合成时一般使用1种标记dNTP和3种非标记dNTP作前体；所使用的酶是大肠杆菌DNA聚合酶I经过枯草杆菌蛋白酶处理后形成的Klenow片段，它保留有53聚合酶活性和35外切酶活性, 见图16-6。所用的寡核苷酸一般有商品供应。用此法获得的DNA探针的放射性比活度可达31O941O 10 Bqg。图16-5随机寡核苷酸引导的cDNA全链标记图16-5 Klenow 酶生成示意图3.通用引物指导的cDNA标

16、记噬菌体M13以单链环状形式存在，在它的DNA序列中有一称为多克隆位点的片段，在此片段上有一系列限制性内切酶切点，外源性的DNA可以插入该区域，临近多克隆位点的3端存在一个LacZ基因区，制备与该基因上一小段DNA互补的片段作为引物（即通用引物），在Klenow酶作用下，以插入的外源性DNA（即感兴趣序列）为模板，以1种-32PdNTP和3种非标记dNTP为前体，从通用引物的3端开始合成cDNA, 见图16-7。合成过程结束后使用限制性内切酶消化，并用凝胶电泳方法分离并获得标记的DNA片段。图16-7 在M13重组DNA上制备标记DNA4.与单链RNA互补的DNA标记合成与mRNA互补的DNA

17、通常使用两种引物，如果所用mRNA模板3端具有Poly A结构，就可以用人工合成的寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸（Oligo-dT）作为引物；如果没有Poly A结构，则要使用随机引物。使用前一种引物的缺点是所得到的探针可能含有一段不需要的DNA序列。在逆转录酶作用下，以1种-32PdNTP和3种非标记的dNTP作前体，以mRNA为模板，合成得到标记的cDNA, 见图16-8。图16-8 与单链RNA互补的DNA全链标记为了获得对感兴趣mRNA的高度放射性比活度的cDNA探针，通常在标记时加大mRNA模板用量，或是富集感兴趣的mRNA序列作为模板。如果所得到的探针是用于筛选cDNA文库，那么感兴趣片段

18、所标记到的放射性核素必须大于106 Bq。值得注意的是获得的高比活度探针很容易因为辐射裂解而损伤破坏，因此探针制备后应立即使用。（二）RNA全链标记合成高放射性比活度的单链RNA探针需要经过改造的含有多克隆位点的质粒载体；所用的酶有两种：一种是SP6 RNA聚合酶，它是SP6编码的以DNA为模板的RNA聚合酶，具有极强的启动子特异性，即只能特异性地转录SP6启动子下游的DNA；另一种是T7和T3 RNA聚合酶，同样它也有启动子特异性，只能特异性地转录噬菌体T7和T3启动子下游的DNA。如果在质粒的多克隆位点插入一条所需检测的DNA序列片段，此时，将启动子（如 SP6启动子或 T7启动子）插入质

19、粒的多克隆位点的上游，这样在相应的RNA聚合酶作用下，以插入的靶DNA为模板，转录合成RNA。如果所用的4种rNTP底物中有1种是-32PrNTP，就可以得到与靶DNA片段互补的具有高比活度的标记RNA。用本法制备RNA探针具有其优越性：首先，用此法标记RNA的效率远远高于单链DNA探针制备法，因为合成RNA的DNA模板可以被转录多次，RNA的产量可以数倍于模板DNA的量。其次，用此法制备高比活度的RNA探针相对价格便宜，因为RNA聚合酶功能在底物低达l20 mol时，仍然保持其活性。第三，RNA探针无须经过凝胶电泳高度纯化。第四，用此法制备的RNA探针在杂交时具有较高的敏感性，一般要比大小和

20、比活度相同的DNA探针敏感210倍。RNA的全链标记，还可以用大肠杆菌RNA聚合酶非特异性地把靶DNA转录成RNA，获得放射性比活度1010 Bqg的32P标记RNA。（三）DNA末端标记法DNA分子的末端可以在适当的酶作用下，标记上放射性核素。此法常用于限制性内切酶图谱分析、化学法DNA序列分析。下面作一简要介绍。1Klenow酶催化的双链DNA 3末端标记此法相似于引物指导的cDNA合成，要求待标记的双链DNA-端的5末端突出，而相应的3末端缩进，并含有羟基结构。在反应体系中加入Klenow酶，并加入1种-32PdNTP，加入的这种标记dNTP，由5突出末端的序列决定（根据碱基配对原则）。

21、如果没有这种粘性末端，则经过某种限制性内切酶切割所需要的末端。如选用EcoRI切割产生粘性末端，就可以在反应体系中加入标记的dATP或dTTP，在3末端标上32P。见下面两式：如果我们选用限制性内切酶BamHI切割产生相应的粘性末端，则可以在反应体系中加入-32PdGTP，从而在3末端标上32P，见下式。 而对于钝性末端的标记，则需要通过在3-OH末端进行核苷酸置换反应，来标记上32P。见下式。标记反应可以在用DNA限制性内切酶消化后立即进行，而不必去除限制性内切酶，因为Klenow酶工作条件要求低，适应性强。当标记产物是用于Maxam-Gilbert法进行DNA序列分析时，加入到反应体系中的

22、标记dNTP应当达到最大量，反应过后还需加入适量的4种未标记的dNTP，以便使得到的标记DNA分子一样长。 2.噬菌体T4 DNA聚合酶催化的双链DNA 3末端标记T4 DNA聚合酶与Klenow酶一样，可以用来标记具有3粘性末端的DNA分子。但是T4 DNA聚合酶具有极强的35外切酶活性，因而常用来标记3末端突出的双链DNA分子。见下式:在使用DNA限制性内切酶消化DNA分子后，限制性内切酶要从反应系统中去除，然后再进行末端标记。 3.末端转移酶催化的3末端标记 末端转移酶可以催化DNA分子3-OH端接上。-32P标记的同源多聚核苷酸，其中-32P标记的核苷酸的数量可以从1个到数十个。被催化

23、的DNA分子既可以是单链，也可以是双链。 4.噬菌体T4多核苷酸激酶催化的DNA 5末端标记噬菌体T4多核苷酸激酶催化DNA5末端的32P标记有两条途径，一为正向反应（forward reaction），即DNA 5末端的磷酸被碱性磷酸激酶催化而失去，形成DNA的5OH末端，然后，经过T4多核苷酸激酶作用，将-32PdATP中的32P连接到DNA 5OH末端上形成5末端标记的DNA分子。见下式:另一条途径是交换反应（exchange reaction），即DNA 5末端的磷酸在T4多核苷酸激酶作用下转移到外来的ADP分子上；然后仍在T4多核苷酸激酶作用下，将-32PdATP中-32P转移到DN

24、A 5末端，形成5末端标记的DNA分子。见下式:（四）RNA末端标记1T4多核苷酸激酶催化的5末端标记T4多核苷酸激酶（T4PNK）同样可以催化ATP分子中-P转移到RNA 5-OH末端。但是因为T4 PNK还具有3磷酸酶活性，将使3末端为磷酸的RNA变性，故标记时选用一种突变了的无3磷酸酶活性的T4多核苷酸激酶，催化-32PATP中的-32P标记到RNA5末端，而又不影响RNA活性。2T4 RNA连接酶催化的RNA3末端标记T4 RNA连接酶可以将放射性前体532P Cp连接到RNA3-OH末端上；此标记技术在RNA指纹图谱实验和序列分析研究中非常有用。以上逐一介绍了各种放射性核素核酸标记技

25、术，根据使用标记核酸的目的不同，可以选用不同的方法。核酸的放射性标记技术已经成为核酸序列分析技术、核酸分子杂交技术和基因工程技术的重要组成部分。放射性核素在分子生物学发展中起到了极其重要的作用，并仍然发挥其特殊的作用；它的高度灵敏性仍然是其他标记示踪物所无法超越的。但它也有缺陷，如半衰期短，有放射性危害，操作麻烦，时间长。因而，近年来人们发明了许多非放射性标记物。如用荧光素代替放射性核素；采用夹心法，在核酸上标记生物素，再利用生物素-亲和素-酶联结催化底物产生化学发光来代替放射性核素的自显影，这种化学发光法灵敏度极高，可以快速操作，这是未来发展的方向之一。第三节 放射性核素在核酸序列分析中的应

26、用核酸序列分析是分子生物学研究中最重要的技术之一。它的目的在于测定出核酸（DNA和RNA）的核苷酸排列顺序。它又分为DNA序列分析和RNA序列分析。由于DNA序列分析技术的建立，人们对DNA的认识深入到了核苷酸水平，对基因结构与功能的研究起着十分重要的作用，也为一些分子病的发病机制和基因治疗研究提供了依据。目前，DNA序列分析方法有许多种，如化学切割法、加减法、末端终止法、连续测定法、 M13克隆载体法、热循环测序、固相测序等。尽管方法不同，但有两点是共同的，首先是这些方法都使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，因为它具有极强的分辨率，即使两分子只相差一个核苷酸，也能在凝胶上形成两条分开的带；其次，这些方法

27、都需要经过不同的处理，得到一系列长度只相差一个核苷酸的单链DNA分子。一般DNA序列分析时，所要分析的DNA分子不能太大，长度在400 b左右的分子较理想。目前, 由于技术的进步和分析仪器的发展与成熟, 在分子生物学实验室尤其是一些国家实验室, 都可以进行快速和高通量的测序分析， 如用基因芯片技术。下面介绍几种常用的DNA序列分析技术：一、化学切割法DNA序列分析 此法可以对双链DNA进行序列分析，也可以分析单链DNA。首先要对待测的DNA片段进行末端标记（3或5），标记方法如本章第二节所述；然后用变性拆链的方法，将双链DNA在30二甲基亚砜（DMSO）中热变性，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳拆链的方

28、法，将DNA双链分开成两条单链；或者用酶切方法将标记过的DNA切成两段，这样就得到了只有一端（3或5端）标记过的样品。将样品分别同时进行4种修饰与切割反应，它们是G，G十A，C和C十T。一般使用硫酸二甲酯使A和G两种嘌呤甲基化，用肼使C和T两种嘧啶变为腙，然后使用试剂将修饰过的碱基切掉。例如，在G反应中，所有的G都有可能被切割掉，但就某一个（或一些）分子来说，只有某一个或某几个G被切割掉；因而在G反应中存在不同位置上的G被切割的、从标记的一端算起具有各种长度的DNA分子，同理，其他3个反应也如此。将经化学切断的样品变性，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，样品在凝胶上的迁移率按片段所含核苷酸的多少自下而上

29、排列。电泳后作放射自显影，同样自下而上读每一条带，得到DNA序列。应当注意在C和CT两个反应中，同时出现的带应读为C，只在CT中出现的带读作T，同样，在G和G十A反应中，同时出现的带读作G，只在GA中出现的带读为A。本法实验要求不高，试剂容易购得，但目前尚无特异性较高的切断A或T的反应，所以这两个碱基不易直观显示出来。二、双脱氧核苷酸链终止法作DNA序列分析 它的基本原理是：在引物存在下，利用Klenow酶53的聚合酶活性在单链DNA模板上合成互补链，如果反应体系中加入ddNTP（即2，3-双脱氧核糖核苷三磷酸），它同样可在酶作用下掺入新合成的链，但因为ddNTP3位置上没有羟基，这条链合成到

30、此终止。实验时，首先将欲检测的单链DNA模板接上引物，然后将样品分成4组，每组中含Klenow酶，4种dNTP（其中1种是-32PdNTP），4种ddNTP中的一种。以加ddATP为例，当遇到模板碱基为T时，反应系统中ddATP和dATP都可掺入新链，前者掺入时则链合成终止，后者掺入时，则继续进行链的合成。ddATP掺入是随机的，因此可以得到一系列不同长度的以ddATP为末端的DNA片段。其余3组反应以此类推。把4组反应综合起来，我们就可以得到长度只相差一个核苷酸的一整套DNA分子，将反应得到的DNA变性后电泳，并用凝胶直接作放射自显影，就可以得到自显影带，而每一条带都代表一定长度的单链DNA

31、分子，由低向高逐条解读就可以得到DNA序列。值得注意的是这个解读出来的序列不是所需分析的那条DNA链的序列，而是其互补链的序列。三、 M13载体-链终止法作DNA序列分析 当要分析某一较长的DNA序列时，必须要作出详细的酶切图谱，并把DNA切成长度为300 b左右的短片段，再克隆到M13载体中去，经过转化得到重组克隆，将这些克隆进行悬液培养，从菌体中提取RF型DNA，通过酶切和电泳，确定各个克隆中所含的外源DNA片段，从上清液中提取单链DNA用于序列分析。这一过程称为单链DNA制备。在M13克隆载体中，在克隆部位的3端有一长度为17 b的特殊序列，使用人工合成的一段互补寡核苷酸与之退火，即成为Klenow酶合成反应的引物。然后用链末