孙原原11.docx
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孙原原11
学士学位论文
论文题目：
食用菌多糖抗氧化性的研究
姓名
孙原原
院系
化学与材料科学院
专业
化学（师范类）
年级
2003级
学号
0324220326
指导教师
姜华（教授）
2007年3月24日
独创声明
本人郑重声明：
所呈交的毕业论文（设计），是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议。
尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文（设计）不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式表明。
本声明的法律后果由本人承担。
作者签名：
二00年月日
毕业论文（设计）使用授权说明
本人完全了解鲁东大学关于收集、保存、使用毕业论文（设计）的规定。
本人愿意按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版，同意学校保存学位论文的印刷本和电子版，或采用影印、数字化或其他复制手段保存论文（设计）；同意学校在不以营利为目的的前提下，建立目录检索与阅览服务系统，公布论文（设计）的部分或全部内容，允许他人依法合理使用。
（保密论文在解密后遵守此规定）
论文作者（签名）：
二00年月日
A.2
毕业论文（设计）选题报告
姓名
孙原原
性别
女
学院
化学
年级
03学分
学号
0324220326
论文题目
食用菌多糖抗氧化性能研究
课题来源
自选
课题类别
论文
选做本课题的原因及条件分析：
人们研究发现食用菌具有抗肿瘤，抗病毒，抗衰老，抗氧化，降血脂，提高机体免疫力，减少各种放疗化疗的毒副作用等生理功能。
而食用菌的这些生理作用与其所含的多糖有密切的关系。
实验采用能够产生羟基自由基Fenton体系和产生超氧阴离子自由基的邻苯三酚自氧化体系，用分光光度计测定食用菌多糖对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除作用
指导教师意见：
所选论文题目的研究内容，具有较高的应用价值和实际意义。
同意选做该题目。
签名：
2006年11月27日
学院毕业论文（设计）领导小组意见：
（签章）
年月日
B指导教师用表
毕业论文（设计）任务下达书
学院化学专业化学（师范类）学号0324220326姓名孙原原
现将毕业论文（设计）任务下达书发给你。
毕业论文（设计）任务下达书内容如下：
一、毕业论文（设计）题目
食用菌多糖抗氧化性能研究
二、主要内容
从食用菌子实体中提取粗多糖；食用菌多糖清除羟自由基能力的研究；食用菌多糖清除超氧阴离子自由基能力的研究。
三、具体要求
掌握分光光度计的原理和操作方法；
能够熟练而准确地进行常用分析操作；
能够阅读英文文献。
四、主要参考文献
1、徐向荣,王文华,李华斌.羟自由基的测定方法[J].中国卫生检验杂志,1997,7（5）:
311～313
2、张宏,谭竹钧.四种邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性方法的比较.内蒙古大学学报（自然科学版）,2002,33（6）:
677～681
五、进程安排
阶段
起止日期
主要内容
第一阶段
12.4-12.11
查阅相关文献资料，确定实验方法
第二阶段
12.11-1.10
食用菌多糖清除超氧阴离子自由基试验
第三阶段
1.10-1.25
食用菌多糖清除羟自由基试验
第四阶段
1.25-1.30
撰写论文
六、本毕业设计（论文）任务下达书于2006年12月4日发出。
毕业设计（论文）应于2007年1月30日前完成后交指导教师，由指导教师评阅后提交毕业论文（设计）答辩委员会。
七、毕业设计（论文）任务下达书一式两份，一份给学生，一份留学院存档。
指导教师：
签发于2006年12月3日
分管院长（主任）：
签发于200年月日
A.3
毕业论文（设计）开题报告
姓名
孙原原
性别
女
学院
化学
年级
03学分
学号
0324220326
预计完
成时间
11月15日至1月25日
论文题目
食用菌多糖抗氧化性能研究
课题来源
自选
课题类别
论文
指导教师
姜华
毕业论文（设计）实施方案：
首先通过查阅文献资料，确定采用热水浸提的方法提取食用菌粗多糖；然后采用分光光度法利用改进了的Fenton反应体系测定食用菌粗多糖对羟基自由基的清除作用，通过粗多糖对邻苯三酚自氧化过程的影响测定多糖清除超氧阴离子自由基的能力，并与具有抗氧化作用的维生素C对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除作用作为对比。
论文（设计）主要内容（提纲）：
1、食用菌多糖抗氧化能力的测定方法及多糖抗氧化能力的研究进展。
2、实验部分：
食用菌粗多糖的提取；食用菌多糖清除羟基自由基能力的测定；
多糖清除超氧阴离子自由基能力的测定。
3、结果与讨论：
不同食用多糖清除羟基自由基能力的比较；不同食用菌多糖清除超氧阴离子自由基能力的比较。
指导教师意见：
实验方案设计合理，实验内容全面具体，同意开题。
签名：
2006年12月10日
（签章）
年月日
学院毕业论文（设计）领导小组意见：
（公章）
年月日
（签章）
年月日
A.4
毕业论文（设计）结题报告
姓名
孙原原
性别
女
学院
化学
年级
03学分
学号
0324220326
论文（设计）题目
食用菌多糖抗氧化性能研究
课题来源
自选
课题类别
论文
指导教师
姜华
本课题完成情况介绍（包括研究过程、实验过程、结果分析、存在的问题及应用情况等。
）
本文以香菇、木耳、裙带菜、真姬菇为原料提取粗多糖，并通过改进了的Fenton反应和邻苯三酚自氧化反应，以维生素C和甘露醇为对照，测定了这几种多糖清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力，对其抗氧化性进行了研究。
实验结果表明，香菇、木耳、裙带菜、真姬菇等粗多糖对羟基自由基和超氧阴离子自由基均有一定的清除作用，其中羟基自由基清除率达50%时香菇粗多糖浓度为199μg/ml，木耳为149μg/ml，裙带菜为263μg/ml。
相同浓度的多糖溶液清除超氧阴离子自由基的能力大小依次是木耳粗多糖、香菇粗多糖、裙带菜粗多糖。
指导教师意见：
签名：
2007年3月12日
（签章）
年月日
学院毕业论文（设计）领导小组意见：
（公章）
年月日
（签章）
年月日
论文（设计）
成绩
D.3
毕业论文（设计）答辩成绩评分表
（答辩委员会用表）
学院化学与材料科学学院学号0324220326姓名孙原原
评价内容
具体要求
分值
评分
A
B
C
D
E
报告内容
思路清晰；语言表达准确，概念清楚，论点正确；实验方法科学，分析归纳合理；结构严谨；论文结果有应用价值。
50
50
45
40
35
30
创新
对前人工作有改进或突破，或有独特见解。
10
10
9
8
7
6
答辩
回答问题有理论根据，基本概念清楚，主要问题回答准确、有深度。
30
30
27
24
21
18
报告时间
符合要求。
10
10
9
8
7
6
总分
答辩委员会委员（小组）签名：
、、
、、
D.4
毕业论文（设计）答辩情况记录表
学院：
化学与材料科学学院答辩日期：
2007年3月日
姓名
孙原原
性别
女
专业
化学
年级
03级学分
学号
0324220326
论文（设计）题目
食用菌抗氧化性能的研究
答辩时间
时分至时分
答辩地点
记录人
答辩委员会（小组）出席情况：
主任（组长）签名：
委员（成员）签名：
答辩记录：
（所提出问题及对问题答辩要点）
（可以加页）
D.5
毕业论文（设计）成绩评定表
学院：
化学与材料科学学院学号：
0324220326
姓名
孙原原
论文（设计）总成绩：
论文（设计）题目
食用菌抗氧化性能的研究
指
导
教
师
评
语
评定成绩：
签名：
2007年3月16日
评
阅
人
评
语
评定成绩：
签名：
年月日
答
辩
小
组
评
语
答辩成绩：
组长签名：
年月日
注：
1、论文（设计）总成绩=指导教师评定成绩（50%）+评阅人评定成绩（20%）+答辩成绩（30%）2、将总成绩由百分制转换为五级制，填入本表相应位置。
食用菌多糖抗氧化性的研究
孙原原
（化学与材料科学学院，化学教育，03级学分二班，0324220326）
摘要：
本文以香菇、木耳、裙带菜、真姬菇为原料提取粗多糖，并通过改进了的Fenton反应和邻苯三酚自氧化反应，以维生素C和甘露醇为对照，测定了这几种多糖清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力，对其抗氧化性进行了研究。
实验结果表明，香菇、木耳、裙带菜、真姬菇等粗多糖对羟基自由基和超氧阴离子自由基均有一定的清除作用，其中羟基自由基清除率达50%时香菇粗多糖浓度为199μg/ml，木耳为149μg/ml，裙带菜为263μg/ml。
相同浓度的多糖溶液清除超氧阴离子自由基的能力大小依次是木耳粗多糖、香菇粗多糖、裙带菜粗多糖。
关键词：
食用菌； 多糖； 抗氧化；自由基
Abstract:
Inthisarticle,thepolysaccharideswasisolatedfromediblefungisuchasmushroom,auriculariaauricula,undariapinnatifida,andsoon.AndthroughimprovedtheFentonresponseandthepyrogallicacidfromtheoxidizingreaction,wehasdeterminedthesekindofpolysaccharideeliminationhydroxylfreeradicalandultraoxygenanionfreeradicalabilitybytakingVitaminCandthemannitolasthecomparison.Theexperimentalresultindicatedthatthepolysaccharidefrommushroom,theauriculariaauricula,theundariapinnatifidahascertainscavengingactiontothehydroxylfreeradicalandtheultraoxygenanionfreeradical.Thescavengingactivitytohydroxylfreeradicalwasrepresentedbythecontentofscavenging50%ofallradicals（Ec50）.TheEc50ofpolysaccharidefrommushroomtohydroxylfreeradicalwas199μg/ml,andauriculariaauriculafor149μg/ml,undariapinnatifidafor263μg/ml.Thesamedensitypolysaccharidesolutioneliminatestheultraoxygenanionfreeradicalabilitysizeisinturntheauriculariaauriculathickpolysaccharide,theshiitakemushroomthickpolysaccharide,theundariapinnatifidathickpolysaccharide.
Keywords:
ediblefungi;polysaccharide;antioxidation;freeradical
目录
1．引言………………………………………………………………………………
1
1．1食用菌多糖的提取、纯化…………………………………………………………
1
1.2多糖的抗氧化性…………………………………………………………………
3
1.2.1多糖的抗氧化机制
3
1.2.2清除羟基自由基活性分析方法
4
1.2.3清除超氧阴离子自由基活性分析方法
4
2实验部分
5
2.1材料与试剂
5
2.2仪器设备
5
2.3实验方法
5
2.3.1粗多糖的制备
6
2.3.2清除羟基自由基的实验方法
6
2.3.3清除超氧阴离子自由基的实验方法
7
3结果与讨论
7
3.1清除羟基自由基实验研究
7
3.2清除超氧阴离子自由基实验研究
15
4.结论
16
5.结束语
17
参考文献
17
致谢
19
1引言
食用菌已经成为人们日常生活中的一种重要的食品，它不仅味道鲜美，而且营养丰富。
近年来，人们对食用菌的研究也越来越深入广泛，人们研究发现食用菌具有抗肿瘤，抗病毒，抗衰老，抗氧化，降血脂，提高机体免疫力，减少各种放疗化疗的毒副作用等生理功能。
食用菌的这些生理作用与其所含的多糖有密切的关系。
有关文献就曾经报道，发现食用菌中提取的水溶性多糖可以抑制肿瘤的生长[1]。
多糖是由多个单糖分子以糖苷键结合而成的天然高分子化合物，广泛存在于植物、动物和微生物的组织中，是生命机体的重要组成部分。
多糖在机体内具有特殊的活性和多种生物学功能。
真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出来的，能够控制细胞分裂分化，调节细胞生长衰老的一类活性多糖。
真菌多糖在国际上被称为“生物反应调节剂”简称BRM，作为一种生物非特异性免疫促进剂，具有抗肿瘤，抗病毒，延缓衰老，讲学质，护肝排毒，促进核酸和蛋白质生物合成等多种生物功效[2]。
近年来，对多糖的活性研究表明，其中部分多糖对物理化学以及生物来源的多种活性氧（ReactiveoxygenspeciesROS）具有清除作用，这其中三个具有代表性的自由基：
超氧阴离子自由基（O2•—），羟基自由基（•OH），脂质过氧化物（LPO）[3，4]，其中超氧阴离子自由基（O2•—）和羟基自由基（•OH）是生物体内两种重要的自由基，地球上的生物大多是需氧生物，在氧分子接受电子还原为水的过程中首先产生O2•—或其质子化产物，如果能在此阶段将其淬灭，阻断自由链式反应，无疑具有十分重要的意义。
•OH是体内最活跃的活性氧，可介异许多病理变化[6]。
自由基的产生与机体的许多功能障碍和疾病的发生如吞噬，解毒，炎症，肿瘤，衰老，辐射损伤等有密切关系，氧化代谢过程中自由基一旦产生，便会呈几何级数增长，直到加入自由基清除剂后才会减少和消失。
以下从食用菌多糖的提取、抗氧化活性及作用机理等方面作了综述。
1.1食用菌多糖的提取纯化[10-15]
食用菌多糖的提取流程一般是固体原料→粉粹→脱脂→溶剂浸提2~3次→浸取液浓缩→醇沉→真空低温干燥→粗多糖制品。
得到的粗多糖一般含有蛋白质、色素、低聚糖等小分子杂质。
所以要得到比较精制的多糖还需要进一步的纯化，一般的纯化过程包括去蛋白，除色素，除低聚糖、氨基酸等小分子杂质，最后要得到分子量不同的纯化多糖还要进一步纯化
食用菌多糖的提取常常受提取时间，温度，PH值，加水量，提取次数，乙醇沉淀浓度等因素的影响，从而影响多糖提取率的高低。
为解决这个问题我们在提取过程中可采用正交实验方法通过排除或减少干扰因素，确定最佳提取方法，提高食用菌多糖的提取率。
1.2多糖的抗氧化性
1.2.1多糖抗氧化作用的机制
近几年来，随着自由基生物学与自由基医学研究的迅速发展，现已证明多种疾病的发生和发展与自由基对组织细胞的损伤关系密切[16]。
如果自由基的产生和清除失衡，就会对机体造成损伤，导致疾病。
大量研究表明多糖具有抗氧化性，但是对于多糖抗氧化性的机理现在才刚刚起步，有些机理还不甚明确，人们认为多糖的抗氧化性机理可能与以下几种情况有关：
（1）多糖分子间接作用与自由基本身。
具体又可以分为两种：
①多糖直接作用于抗氧化酶。
通过提高体内原有抗氧化酶如：
SOD，CAT，GSH2Px等的活性，间接发挥抗氧化作用。
②多糖分子络合产生活性氧所必需的金属离子。
多糖结构中的醇羟基可以与产生•OH
等自由基所必需的金属离子（如Fe2+，Cu2+等）络合，使羟基自由基的产生受到抑制，进而影响脂质过氧化的启动，最终抑制活性氧的产生[17]
（2）多糖分子直接作用于自由基本身。
对于脂质过氧化而言，多糖分子可以直接捕获脂质过氧化链式反应中产生的活性氧，阻断或减缓脂质过氧化的进行；对于•OH而言，多糖碳氢链上的氢原子可以与其结合成水，达到清除•OH的目的，而多糖的碳原子则因此成为碳自由基，并进一步氧化形成过氧自由基，最后分解成对机体无害的产物；对于超氧阴离子自由基而言，多糖可与其发生氧化反应，达到清除的目的[18]。
1.2.2清除羟基自由基活性分析方法
目前国内外对有关•OH的分析测定方法有许多报道，关于•OH的分析一般是通过一定的体系产生•OH，再用一些方法来测定反应产生的•OH，产生•OH的体系有Fe3+—EDTA—抗坏血酸—H2O2体系，Fe2+—EDTA—H2O2体系，抗坏血酸—Cu2+—H2O2体系和黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶—H2O2体系及紫外光照H2O2光解产生•OH等[18~23]。
测定•OH的方法主要有电子自旋共振法，高效液相色谱法，化学发光法，荧光分析法和分光光度法[33]。
电子自旋共振法和高效液相色谱法测定•OH，虽然灵敏度较高，但是所需仪器昂贵，操作也比较复杂，一般实验室难以应用。
化学发光法操作简便，不需要昂贵的仪器，测定快速。
曾有人[24]用化学发光法测定抗坏血酸—Cu2+—H2O2体系产生的•OH。
荧光分析法灵敏度同样很高而且仪器也较化学发光法普及，徐向荣等[25]采用Ce3+荧光分析法测定Fenton反应产生的•OH，该法简便实用，测定快速。
与以上方法相比应用最广泛最普及的还是分光光度法，李平等[26]利用分光光度法检测各种自由基清除剂对Fe2+—EDTA—H2O2体系产生的•OH的清除作用。
其原理是Fenton反应是经典的产生•OH的体系，可认为能模拟人体内产生•OH的过程，该反应是以双氧水为氧化剂，在亚铁盐作用下的氧化反应：
Fe2+ + H2O2 →Fe3+ + •OH + OH—
反应产生的羟基可以氧化番红使其褪色，利用分光光度法检测吸光度变化间接测定所产生的羟自由基。
在加入H2O2前加入羟基自由基清除剂，Fenton反应产生的羟自由基被清除或部分清除，体系在520nm波长处的吸光度降低程度相应减少，采用固定反应时间法，在520nm波长处测量被测物反应液的吸光度并与空白液比较，从而测定被测物对•OH的清除作用。
用番红与羟自由基反应的光度测定法，李平等利用分光光度法测定过山茱萸多糖清除羟自由基的能力，但是由于反应体系中H2O2含量过高，使实验结果误差很大，为此我们通过试验对该方法进行了改进，确定了最佳反应条件。
1.2.3清除超氧阴离子自由基活性分析方法
对于超氧阴离子自由基（O2•—）分析测定方法与•OH的分析方法相似，一般也是通过产生超氧阴离子自由基（O2•—）的体系产生O2•—，然后再通过各种方法测定O2•—，产生超氧阴离子自由基（O2•—）的体系有黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶—碱性DMSO，甲硫酸非那宗—NADPH[27，28]和邻苯三酚自氧化法[29，30]。
测定•OH的方法同样适用于测定O2•—，另外还有脉冲辐射法、比色法、单扫描极谱法[31]、氧电极法[32]等一些间接测定方法。
由于实验方法需要仪器设备或条件特殊，一般难以满足，所以测定O2•—最常用的方法还是分光光度法。
一般是利用分光光度法检测邻苯三酚自氧化产物从而间接测定反应产生的O2•—，进而研究O2•—清除剂的清除O2•—能力。
其反应原理是：
利用邻苯三酚自氧化反应，测定加入自由基清除剂对产生的O2•—清除作用。
邻苯三酚在弱碱性（Tris-HCl-EDTA缓冲液PH=⒏2）环境中自氧化分解产生O2•—的反应
邻苯三酚O2•— + 其他产物
随着反应的进行，O2•—在体系中不断积累，致使反应液在320nm，325nm，440nm波长的吸光度在反应开始一段时间内随时间变化而线性增长，通过测定邻苯三酚自氧化系统的吸收光谱，确定自氧化速率最大值及最大吸收波长为325nm[29]，在此条件下，测定加入自由基清除剂反应的吸收光谱确定自氧化速率，各系统的自氧化速率为S，清除率为E。
另外人们模拟人体黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶产生O2•—的原理研制出了抗超氧阴离子自由基试剂盒，应用起来更方便。
2 实验部分
2.1材料与试剂
香菇（新鲜市售），东北黑木耳（干，市售），裙带菜（干，市售），真姬菇（市售），真姬菇纯化多糖（ZJ-2），番红为生化试剂，乙醇，丙酮，邻苯三酚，L—抗坏血酸（Vc），双氧水，三羟甲基胺基甲烷，磷酸盐，EDTA-Na-Fe（Ⅱ）等试剂均为国产分析纯。
2.2仪器设备
UV—4802型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司）；SK3200H超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；ZHT型自动恒温电热套，山东鄄城永兴仪器厂；WC/09-05超级恒温箱；恒温水浴锅；FC204电子天平等
2.3实验方法
2.3.1粗多糖的制备
称取干燥的真姬菇10g粉碎，研磨，置于烧杯中加40倍的蒸馏水，混匀，超声波15min后于90℃恒温水浴锅中搅拌浸提3h，减压抽滤，提取液置于烧杯中，残渣以同样的方法提取，合并两次提取液，浓缩至原来体积的三分之一，将浓缩液加到三倍体积的无水乙醇中醇沉24小时，减压抽滤，沉淀物依次用95%乙醇，丙酮洗涤，60℃烘箱干燥，即得到真姬菇粗多糖。
将新鲜香菇撕碎烘干，称取9g，粉碎，置于烧杯中加入20倍体积的蒸馏水混匀，在80℃恒温水浴锅中搅拌浸取5h，减压抽滤，提取液置于烧杯中，浓缩至原来体积的三分之一，将浓缩液加入三倍体积的无水乙醇醇沉24h，减压抽滤，用无水乙醇洗涤，将沉淀于60℃烘箱中干燥称重，得香菇粗多糖。
称取干木耳10g，粉碎，置于烧杯中加60倍体积的蒸馏水，混匀在80℃水浴锅中搅拌浸取4h，减压抽滤，提取液置于烧杯中，浓缩至原体积的三分之一，将浓缩液加入三倍体积的无水乙醇醇沉24h，减压抽滤，用无水乙醇洗涤，将沉淀于60℃烘箱中干燥称重，得木耳粗多糖。
称取裙带菜10g，粉碎，置于烧杯中加20倍体积的蒸馏
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