高级化学生物学研究进展.docx

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高级化学生物学研究进展

博士□基地班硕士□

硕博连读研究生□兽医硕士专业学位□

学术型硕士■工程硕士专业学位□

农业推广硕士专业学位□全日制专业学位硕士□

同等学力在职申请学位□中职教师攻读硕士学位□

高校教师攻读硕士学位□风景园林硕士专业学位□

研究生课程考试试卷封面

（课程名称：

高级化学生物学研究进展）

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专业学科化学生物学

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评卷教师签字处

循环肿瘤细胞分离与检测

摘要：

肿瘤扩散是造成肿瘤相关死亡的主要原因,而肿瘤细胞自发循环导致肿瘤远处转移。

因此,特异、敏感地检测循环肿瘤细胞非常重要,不仅能够更加准确地评估肿瘤患者的预后,还有利于制定个性化治疗方案。

本文就循环肿瘤细胞的富集、分离、检测和分析方法作一综述。

关键词:

肿瘤循环细胞;分离;检测

Abstract:

Disseminatedmalignancyisthemaincauseofcancer-relateddeath.Thespontaneouscirculationoftumorcellsisresponsiblefordistantmetastasis;thereforeitisofpotentialimportancetospecificallyandsensitivelydetectthecirculatingtumorcells,whichnotonlyallowsformoreaccuratepredictionofcancerprognosis,butalsohelpstotailorindividua-lizedanticancertreatment.Thispaperreviewstheenrichment,detectionandanalyzingmethodsofcirculatingtumorcells.

Keywords:

neoplasmscirculatingcells;isolation;detection

根据肿瘤细胞转移的途径,在血液或淋巴管中循环的肿瘤细胞被定义为循环肿瘤细胞（circulatingtumorcell，CTC）,而其中若干细胞聚集形成的细胞团块被称为循环肿瘤微栓（ci-rculatingtumormicroemboli，CTM）。

CTM是肿瘤细胞的“集体迁移”行为,因其能够抵抗细胞凋亡、保持细胞增殖能力而具有更高的转移潜能[1]。

由于循环肿瘤细胞含量非常少以及缺乏有效的特异性标志物,有关CTC的研究进展比较缓慢。

现有的分离、检测技术方法各有利弊,至今尚未有一个统一的实验方案和标准。

1CTC富集方法

CTC在外周血中的含量极少,每10ml血液中可能仅含少数几个CTC或CTM,而10ml血液则含有大约1亿个白细胞和500亿个红细胞。

因此,只有首先对临床血样中的CTC

进行富集,然后才能进行检测和生物学性质与基因分析。

现有的富集方法通常是基于CTC的物理性质（密度和大小）或免疫磁性。

1.1梯度密度离心法即依据不同类型细胞沉降系数不同而进行分离。

将全血直接平铺于Ficoll（瑞典Amersham公司）、Lymphoprep（挪威Nycomed公司）或其他密度梯度液上。

离心后,各个成分被分层分离,由下至上依次是红细胞、中性粒细胞、密度梯度液和单个核细胞（包括淋巴细胞、单核细胞、上皮细胞和肿瘤细胞）,最上层是血浆。

由于肿瘤细胞可能会移入血浆组分,而且如果不能立即离心会影响各类细胞的分层效果,于是产生了新的改进技术）OncoQuick（德国Greiner公司）,即一个内置一层多孔膜屏障的50ml离心管,密度梯度液置于膜下。

15~35ml全血被平铺于多孔膜上,通过离心将肿瘤细胞、上皮细胞、血小板和小部分白细胞与其他细胞分离。

肿瘤细胞掺杂实验显示,与Ficoll相比,OncoQuick能更好地富集肿瘤细胞,使后续实验（如细胞染色、免疫标记和分子生物学研究等）相对简单[2]。

虽然OncoQuick可避免离心前全血与密度梯度液混合,但是与其他梯度密度离心方法一样,其敏感性较低,不仅容易造成肿瘤细胞丢失[2-3],而且如果血液抗凝不完全,微小凝块则可能使肿瘤细胞落至梯度密度液的底部。

1.2过滤法2000年Vona等[4-5]报道了一种依据细胞大小,通过过滤直接富集上皮性肿瘤细胞的方法（isolationbysizeofepithelialtumorcells,ISET）。

8μm孔径的聚碳酸酯膜可使较小的淋巴细胞和中性粒细胞通过,而较大的肿瘤细胞则被阻滞在膜上。

该方法不仅操作简单,而且比较敏感,可避免烦琐的多步骤分离造成的稀少细胞的破坏和丢失。

重复性实验显示,ISET可从1ml血中将掺入的1个肿瘤细胞分离出来[6]。

具有高转移潜能的CTM也能被富集和计数。

富集到的细胞可进行细胞学染色,或通过免疫标记、荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）、TUNEL等方法分析其抗原、非整倍性和细胞凋亡等。

在进行激光显微切割后,还可对CTC或CTM进行分子水平的分析[4]。

例如Pinzani等[6]在ISET富集、显微切割之后,研究了肿瘤细胞中HER-2DNA扩增产物。

1.3免疫磁性分离法这是目前最为常用的CTC富集方法,甚至已有FDA批准上市的专业产品CellSearchTMSystem（Veridex）。

针对上皮细胞抗原EpCAM、BerEP4、CK或器官特异性标志物（如mammoglobulin、PSA、CEA和HER-2）的抗体通常被用来分离CTC,富集效率可达1×104~2×105倍[7]。

为了进一步降低血细胞含量,提高富集效率,可以将阴性分选与阳性分选相结合。

阴性分选采用的标志物通常是白细胞表达的CD45或巨噬细胞、血小板表达的CD61。

另外,为了提高CTC富集的特异性,最近的研究倾向于将物理分离方法和免疫磁性分离方法相结合。

例如,Morgan等[8]先用Ficoll-Hypaque离心分离,接着进行免疫磁性阳性、阴性分选,最后在荧光染色的基础上用显微操作技术收集高效富集的前列腺肿瘤细胞。

免疫磁性分离法效率高,且在整个过程中可避免细胞溶解,使目的细胞的计数成为可能。

但其费用较高;并且由于尚无针对CTC的特异性抗原,目前采用的抗体会造成假阳性或假阴性结果。

上皮细胞特异性抗体不仅能特异性标记非肿瘤上皮细胞,还有可能非特异性标记非上皮性非肿瘤细胞（如白细胞）,因此会产生假阳性结果。

正常对照中CK阳性细胞的比例为0~20%[3,9],其中大多是白细胞。

在无恶性肿瘤的受试者外周血中可以检测到数量不等的上皮细胞[3],这与受试者的良性上皮细胞增殖性疾病、炎症、组织创伤和手术干预以及采血操作有关[9-10]。

器官特异性抗体也有同样的弊端,因为并不是所有肿瘤细胞都表达这些抗原,所以会造成假阴性结果。

实际上,现有抗体没有一个具有100%肿瘤或组织特异性[9]。

造成CTC丢失还有另外一个重要原因,那就是上皮-间质转变（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）,即恶性肿瘤细胞为了获得运动性和侵袭性丢失了某些上皮细胞的表型,获得了某些间充质细胞的形态学和基因型特征。

多数恶性肿瘤细胞在脱离原发灶、侵袭远处器官过程中发生EMT,丢失了上皮抗原。

这意味着以上皮细胞为靶细胞的检测方法很容易漏掉那些最具有侵袭能力的肿瘤细胞。

研究发现[11],在不同组织类型的134例肿瘤中,仅70%表达EpCAM。

Fehm等[12]发现,乳腺癌患者血液中CK阴性的非整倍体细胞（缺少上皮抗原的肿瘤细胞）数量多于CK阳性细胞。

进一步的研究发现,CK8、CK18和CK19在来源于播散肿瘤细胞的细胞系中表达缺失[13]。

此外,免疫磁性分离法无法用来检测CTM,因为多步细胞标记和处理会使细胞团块离散。

2CTC检测方法

2.1免疫学检测法CellSearch是一种基于免疫学的检测方法,已被FDA批准用于预测乳腺癌患者的生存期。

基本流程是:

用EpCAM抗体磁珠对上皮细胞进行富集后,将细胞通透、固定,用DAPI荧光核染料、CD45荧光抗体和CK8、CK18以及CK19荧光抗体标记细胞,然后采用半自动四色荧光显微镜Cell-SpotteroRAnalyzer进行分析,检测CK阳性、CD45阴性的上皮细胞。

CellSearch是一个半自动化检测过程,可以减少人为因素造成的误差,还可以对获得的超过一定数目的CTC进行分子生物学研究,因此具有大规模临床应用的潜能。

2008年,一项针对1500例乳腺癌患者的临床试验发现,在化疗前10%患者每7.5ml外周血中含有1个以上CTC,在治疗后这部分患者仍有10%CTC阳性[14]。

与其他免疫磁性富集CTC所遇到的问题一样,免疫组织化学所选择的CTC标志物依然是争论的焦点。

CellSearch法涉及的EpCAM、CK8、CK18和CK19抗体都是上皮细胞特异性的。

如前所述,由于外周血中存在一定数量的非肿瘤性上皮细胞（循环上皮细胞）,加上大多数恶性CTC由于EMT丢失了上皮抗原而无法被检测到,当CTC计数用于评估肿瘤对治疗的反应、肿瘤复发风险以及肿瘤筛查时,这些问题就显得特别重要。

2.2基于RT-PCR检测法即通过分析上皮细胞或肿瘤细胞的正常起源组织特异的候选基因的表达来检测CTC。

其灵敏度非常高,一般可在106~107个正常细胞中检出1个目标细胞,大约相当于在0.1~1ml血液中检出1个细胞。

但是该法的一个重要局限是CTC被破坏而无法计数,同时也不能对单个肿瘤细胞进行观察、分析。

另一个局限是难以选择RNA标志物。

鉴于其灵敏度很高,RNA标志物的选择及阴性对照的设置就显得尤为重要。

理想的标志RNA应有如下特点:

在该类型肿瘤的所有肿瘤细胞中均表达,而在外周血白细胞和非肿瘤上皮细胞中完全不表达,也不发生非法转录（illegitimatetranscription）[15]（低水平、非特异性转录,如白蛋白在淋巴细胞中表达[16]）。

如果采用上皮细胞表达分子基因如CK基因作为目标基因,假如血液中存在非肿瘤循环上皮细胞,那么就可能出现假阳性。

有研究发现,CK19mR-NA存在于3.7%的健康人以及14.3%的恶性血液病患者血液中,健康人血液中CK19的检出归因于外周血白细胞非法转录CK19基因[17],或可诱导组织特异性基因转录的细胞因子的分泌增加[15]。

CK20也有相似情形。

器官特异性标志基因如前列腺特异抗原PSA/KLK3,在所有的前列腺细胞中表达。

因此,如果因炎症、侵入性诊断操作（如活检）或手术导致非肿瘤前列腺细胞进入血液,就会出现假阳性结果。

肿瘤特异性标志物也可能在非肿瘤细胞中表达。

例如,甲胎蛋白在肝脏来源的非肿瘤细胞中表达,癌胚抗原转录产物在健康志愿者和炎性肠病患者血液中也能检测到,而HER-2mRNA则出现在10%健康女性和大多数健康志愿者血液样本中[18]。

部分解决的方案是将多个标志物联合起来进行检测。

Shen等[19]用Survivin、hTERT和hMAM3个标志物检测乳腺癌患者CTC,提高了平行测验的灵敏度和系列测验的特异性。

由CK20、CK19、CEA、GCC4个基因组成的分子谱可以识别87.7%肿瘤转移,假阳性率仅有2.2%[20]。

2.3酶联免疫斑点技术免疫细胞化学法和RT-PCR法存在一个共同的缺陷:

不能区分活细胞和凋亡细胞。

酶联免疫斑点（enzyme-linkedimmunospot,ELISPOT）是一种在单细胞水平检测细胞分泌蛋白的免疫学技术。

而在此基础上特别设计的EPISPOT（epithelialimmunospot）则被用来研究循环上皮细胞。

应用EPISPOT检测到的细胞均是有活力和有功能的CTC,所得数据更加准确、可信,且有实际意义。

以MUC-1和CK19作为标识蛋白检测乳腺癌CTC,发现分泌MUC-1的CTC存在于所有受试乳腺癌转移患者中,但不存在于正常对照中[21]。

2.4CTC芯片技术近年报道了一种基于微流体学的CTC检测技术,称CTC芯片（CTC-Chip）。

CTC芯片是一张与标准载玻片尺寸相同的硅片,上面排列了78000个蚀刻特殊几何图案的固相支持物,支持物上包被了EpCAM抗体。

受检全血在空气的推力作用下与CTC芯片表面紧致排列的支持物最大化接触,其中被EpCAM抗体高效捕获的细胞被确认为CTC（通过免疫染色区分是上皮性细胞还是非特异性结合的白细胞）,然后可以计数,或用分子特征鉴定的方法进行分析。

由于全血未经任何预处理,且CTC在通过芯片的过程中绝对压力极小,因此捕获到的CTC98%具有活力[22]。

该方法大大提高了敏感性和从全血中捕获稀少细胞的得率,同时操作过程简单温和,从而使分离到的CTC保持活力。

另外,CTC芯片平台非常灵活,各种不同的抗体都可以包被在固相支持物上,从而分离到不同类型的CTC。

Nagrath等[22]对取自68例上皮性肿瘤患者的116份血样进行CTC芯片检测,在其中的55份来自早期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的血样中全部分离到CTC。

在包括结肠癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌在内的其他肿瘤中也发现了相似的结果。

如此多数量的CTC与其他方法检测得到的结果有显著差异。

用CellSearchTM法对来自99例早期肺癌患者的168份血样进行分析[23],仅从34份（20%）血样中检测到CTC,其中仅10份（6%）样品中CTC数目大于6,其余更少。

3CTC分析

CTC分析对于进一步获得其恶性特征相关数据及评价单个CTC的侵袭潜能非常重要。

动物实验研究发现,10000个CTC中只有1个能形成转移灶[24]。

尽管这个数据在人体中可能会有所不同且与肿瘤的差异性有关,但有一点很明确,那就是有必要鉴定并研究最具转移潜能的CTC。

经细胞病理学确认的CTC被激光显微切割后,可用定量PCR技术分析其癌基因扩增产物和癌基因突变。

Panayiotis等[25]应用免疫标记分析富集的乳腺癌CTC,发现有35.2%的CD44+/CD24-/low、17.7%的ALDH1high/CD24-/low恶性高致瘤细胞。

FISH、比较基因组杂交（comparativegenomichybridization,CGH）等方法也可被用来直接对CTC进行分析。

只要CTC的富集步骤未使细胞形态受到破坏,细胞病理学分析可常规进行。

但是,由于技术及操作成本原因,基因组分析、突变分析目前尚未应用于CTC常规检测,而仅用于CTC实验研究。

另外,用CK染色和TUNEL分析发现,在乳腺癌患者血液中检测到的上皮细胞中有相当数量的凋亡细胞[26]。

抗肿瘤治疗前后进行循环凋亡细胞的检测和计数可评价治疗措施的促凋亡作用,具有重要意义。

然而必须考虑到,添加了防腐剂的血液储存会使细胞变得脆弱,而多步骤操作和与磁珠的接触则可能会诱导其凋亡[27]。

4CTC检测的临床意义

目前,针对不同类型恶性肿瘤的研究都在试图阐述肿瘤患者CTC的检测在诊断及预后评估中的价值。

一项大规模的Ⅱ期临床研究表明,乳腺癌患者术后或化疗前CTC的检出是肿瘤早期复发的独立预测指标[28]。

治疗前后CTC数目的变化可以评估治疗的反应:

CTC数量下降则治疗有效,而CTC数量上升则提示治疗无效或肿瘤进一步发展[29]。

但是由于现有方法的各种缺陷和可能存在的假阳性、假阴性结果,使其得出的数据的准确性面临挑战。

除此之外,CTC临床研究还面临一个标准化的问题。

由于不同肿瘤类型、疾病分期以及接受的治疗不同等因素,造成数据结果呈现不均一性。

因此,应该进行多中心性研究,由相同疾病类型、阶段,接受相同治疗,具有相同风险的患者群体得到的研究数据,才能够较为准确地帮助我们分析CTC的生物学特征以及其作为预后评估因素的作用。

另一个重要决定要素是确定一个标准化、统一并且特异、敏感的CTC细胞学检测方法。

规范、完善的临床试验有望产生可靠的结果,并为CTC这一标志物应用于临床肿瘤学提供指南。

针对稀少循环肿瘤细胞的常规分子生物学技术的进步,以及新的肿瘤标志物的发现,将为CTC研究提供新的更可靠的工具。

这将有利于拓展人们对CTC的进一步了解,更重要的是,得到新的CTC相关数据可以指导临床医生采取更为合理的诊疗措施,提高患者生活质量和预期寿命。

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