两种药用植物内生真菌次生代谢产物及其生物活性的研究.docx
《两种药用植物内生真菌次生代谢产物及其生物活性的研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《两种药用植物内生真菌次生代谢产物及其生物活性的研究.docx（27页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
两种药用植物内生真菌次生代谢产物及其生物活性的研究
两种药用植物内生真菌次生代谢产物及其生物活性的研究
论文分类号：
2学校代码：
10708
学号：
BS0908005
博士学位论文
DissertationforDoctor’sDegree
两种药用植物内生真菌次生代谢产物
及其生物活性的研究
SECONDARYMETABOLITESOFENDOPHYTICFUNGIFROM
TWOMEDICINALPLANTSANDTHEIRBIOACTIVITIES
张弘弛
指导教师姓名：
马养民
学科名称：
应用化学
论文提交日期：
论文答辩日期：
学位授予单位：
答辩委员会主席：
评阅人：
申请工学博士学位论文
论文题目：
两种药用植物内生真菌次生代谢产物
及其生物活性的研究
学科门类：
工学
一级学科：
化学工程与技术
培养单位：
化学与化工学院
博士生：
张弘弛
导师：
马养民教授
2012年10月
SECONDARYMETABOLITESOFENDOPHYTIC
FUNGIFROMTWOMEDICINALPLANTSAND
THEIRBIOACTIVITIES
ADissertationSubmittedto
ShaanxiUniversityofScienceandTechnology
inPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeof
DoctorofEngineeringScience
ByZhangHongchi
DissertationSupervisor:
ProfessorMaYangmin
October,2012
两种药用植物内生真菌次生代谢产物及其生物活性的研究
摘要
植物内生真菌是具有高度多样性的微生物资源，代谢产物多种多样，目
前被认为是抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、杀虫等天然活性物质的重要资
源。
为了寻找更多的生物活性物质，本论文采用活性追踪的方法，研究了4
株来源于药用植物的内生真菌的活性代谢产物。
内容包括：
药用植物（杜仲
和无花果）内生真菌的分离的初步鉴定；抗菌活性菌株的分级组合筛选；活
性菌株的鉴定和发酵条件考察；活性成分的追踪分离；单体化合物的结构解
析；单体化合物生物活性的初步评价。
概括如下:
（1）以杜仲和无花果为研究对象，共获得了119株内生真菌。
从杜仲
根、茎、叶中分离得到62株内生真菌，初步形态学鉴定，这些内生真菌分
属于7目，9科，15属，其中曲霉属Aspergillussp.，镰孢霉属Fusriumsp.，
链格孢属Alternariasp.是杜仲内生真菌的优势种群。
从无花果根、茎、叶中
分离得到57株内生真菌，初步形态学鉴定，分属于7目，10科，21属。
其
中镰孢霉属Fusriumsp.，青霉属Penicilliumsp.，曲霉属Aspergillussp.是无
花果内生真菌的优势种属。
不同部位分离内生真菌的数量、种类和分布不尽
相同，这就表明这两种药用植物的不同部位内生真菌的数量、分布和种群存
在差异。
（2）采用抗菌活性筛选为主、代谢产物化学成分筛选为辅的二级组合
筛选模式，得到如下结果：
抗菌活性初筛确定活性菌株共有20株（杜仲内
生真菌11株，无花果内生真菌9株），筛选率为16.8%；抗菌活性复筛筛
选到12株高抗菌活性的内生真菌，筛选率为10.1%；结合化学成分复筛最
后确定了ER12、EL09、FR02、FL10这4株具有高抗菌活性，并且代谢产
物种类丰富的内生真菌作为本论文的研究对象。
（3）根据菌株的形态、培养特征、18SrDNA以及ITS序列分析结果，
对活性菌株ER12、EL09、FR02和FL10进行菌种鉴定，分别鉴定为刀孢蜡
蚧菌、黑曲霉、溜曲霉以及三线镰孢。
以菌丝体生物量、发酵产物重量、抗
菌活性、薄层色谱分析以及高效液相色谱分析为评价依据，对4株活性内生
真菌进行了发酵产物稳定性试验，培养基选择试验，发酵时间试验，萃取实
验，确定了4株活性内生真菌的扩大培养条件以及提取条件。
（4）经过扩大培养，采用常规的硅胶柱层析、反相硅胶柱层析，凝胶
I
SephadexLH-20柱层析、制备薄层层析以及重结晶等分离手段，从4株活性
内生真菌分离到90个单体化合物。
利用各种现代波谱技术（EI-MS、
11311
HR-ESI-MS、H-NMR、C-NMR、DEPT、H-HCOSY、HSQC、HMBC等）
并结合化学方法鉴定了这90个化合物的结构，其中新化合物3个，分别是
malforminE（19）、cyclo-N-methyl-Trp-Leu（62）和helovlicacidester（83）。
从ER12中分离到34个化合物，其代谢产物的结构类型是12个环二肽
类化合物（3-10，13-16），1个新的环五肽化合物（19），4个fumiquinazoline
生物碱类化合物（17，18，22，23），2个二苯酮类化合物（20，21），1个
咪唑类化合物（12），2个甾体化合物（1，2），8个苯的衍生物（11，24-28，
31，32）及4个核酸苷（29，30，33，34）。
从EL09中分离到18个化合物，
其代谢产物的结构类型是9个甾体类化合物（38-44,1,2），3个脂肪酸
（35-37），2个呋喃类化合物（45，46），2个多羟基醇化合物（47，48）及
2个吲哚类化合物（49，50）。
从FR02中分离到22个化合物，其代谢产物
的结构类型是13个吲哚二酮哌嗪类化合物（53-65，其中62为新化合物，
65为新天然产物），2个萜类化合物（51，52），2个甾体化合物（1，39），
2个多元羧酸（67，68）和1个多元醇（66）。
从FL10中分离到33个化合
物，其代谢产物的结构类型是7个gliotoxin类化合物（74-80），3个烟曲霉
酸的衍生物（81-83），3个环二肽化合物（13，14，84），5个脂肪酸（69-71，
36，37），4个甾体化合物（1，39，72，73），3个苯的衍生物（87-89），4
个碱基或核酸苷（29，30，85，86）及4个多元羧酸或多元醇（47，48，68，
90）。
（5）采用MIC法，以11种指示菌（4个细菌和7个植物病原真菌）
为模型，对4株活性内生真菌产生的90个单体化合物进行抑菌活性评价，
结果表明有26个化合物对指示菌显示了较强的抑制作用。
新化合物19
（malforminE）和83（helovlicacidester）对多种指示菌表现了很强的抗菌
作用。
综合分析抗菌活性测试的结果，明确了4株活性内生真菌生物活性物
质的类别，ER12Lecanicilliumpsalliotae的活性物质主要是fumiquinazoline
类生物碱和环肽类化合物；EL09Aspergillusniger的活性物质主要是甾醇类
和呋喃类化合物；FR02Aspergillustamarii的活性物质主要是吲哚二酮哌嗪
生物碱类化合物；FL10Fusariumtricinctumi的活性物质主要是gliotoxin类
生物碱和烟曲霉酸类化合物。
采用MTT法，以3个肿瘤细胞株（MCF-7人乳腺癌细胞、HepG2人肝
癌细胞、A549人肺癌细胞）为模型，对分离得到的新化合物和生物碱类代
II
谢产物的抗肿瘤活性进行了初步评价，结果表明这些化合物对不同肿瘤细胞
系表现出不同程度的增殖抑制活性。
其中新化合物malforminE（19）MCF-7
和HepG2系表现出很好的细胞毒活性，IC50分别是0.65和2.42μM；
fumiquinazolineC（18）和fumiquinazolineJ（23）对HepG2和A549肿瘤
细胞的增殖有抑制作用，verruculogen（56）对HepG2和A549肿瘤细胞表
现出很强的细胞毒性，IC50分别是1.95和2.56μM。
总之，本文经过筛选获得4株活性内生真菌，通过分离鉴定阐明了4
株内生真菌中90个化合物的结构，其中包括3个新化合物。
评价了这些单
体化合物的抗菌活性和抗肿瘤活性，发现了26个单体化合物具有较强抗菌
活性和4个单体化合物具有较强抗肿瘤活性。
上述研究结果证明植物内生真
菌作为植物生态一个重要的组成部分，是新结构和新活性物质的主要来源，
是寻找药物先导化合物的重要资源。
关键词：
药用植物；内生真菌；活性筛选；次级代谢产物；生物活性
III
SECONDARYMETABOLITESOFENDOPHYTIC
FUNGIFROMTWOMEDICINALPLANTSAND
THEIRBIOACTIVITIES
ABSTRACT
Endophyticfungiareaspecialandimportantgroupofmicroorganismswith
taxonomicdiversity,whichshowhighpotentialassourcesofantimicrobial,
antiviral,anticancer,antioxidant,andinsecticidalcompounds.Inorderto
investigatethepotentialbioactivecompoundsderivedfromendophyticfungi,
thisdissertationdescribedthediscoveryofseveralantimicrobialcompounds
isolatedfromfourendophyticfungiofmedicinalplantsbybioassay-guided
fractionation.Studiesincludeisolatingofendophyticfungi,seleetingaimed
strains,fermentationstudies,bioassay-guidedfractionation,structuralelucidation,
preliminaryevaluationofantimicrobialandanti-tumoractivitiesofpure
compounds.Theresultsareconcludedasfollows:
Sixty-twostrainsisolatedfromroots,stemsandleavesofEucommia
ulmoides,wereclassified,identified,andbelongedtofifteengenera,nine
families,andsevenordersaccordingtotheirmorphologicalandmicro-structure
characters.Alternariasp.,Fusriumsp.andAlternariasp.aredominant
endophyticfungipopulationinEucommiaulmoides.Fifty-sevenstrainsfrom
Ficuscaricewereclassified,identified,andbelongedtotwenty-onegenera,ten
families,andsevenorderswhileFusriumsp.,Penicilliumsp.andAlternariasp.
aredominantendophyticfungipopulation.Itshowedthatthequantities,species,
anddistributionoftheendophyticfungusvariedindifferentpartsofEucommia
ulmoidesandFicuscarice.
TheendophyticfungiisolatedfromEucommiaulmoidesandFicuscarice,
werefirstscreenedbyantimicrobialassaytoobtain20strainswhichshowed
strongantimicrobialactivities,andpossessed16.8%oftotal119strainstested.
The20strainsweresubjectedtotheflowantimicrobialsecondaryscreeningand
10strainswerefoundtohavemorestrongactivities,whichpossessed10.1%of
total119strainstested.Onthebasisofantimicrobialactivities,theresultsof
IV
TLCandHPLCanalysis,fourestedstrains,ER12,EL09,FR02andFL10,were
chosenastheaimedstrainstoinvestigatetheirbioactivemetabolitesinthis
study.
Accordingtotheirmorphology,culturalcharacteristics,18SrDNAandITS
sequences,thestrainsER12,EL09,FR02andFL10wereindentifiedas
Lecanicilliumpsalliotae,Aspergillusniger,AspergillustamariandFusarium
tricinctum,respectively.Onthebasisofmyceliabiomass,weightoffermentation
extracts,antimicrobialactivities,theresultsofTLCandHPLCanalysis,
stability-testsforthebioactivecomponentsandfermentationstudiesperfomred
ontheaimedstrains.Thetimecourseexperimentsforthefermentationoffour
strainswerethencarriedout,followedbysolventextractiontestsfortheactive
components.Then,large-scalefermentationandpreparationoftheactive
fractionswereperfomredtoobtaintheactivefractionsofthefourstrains.
Ninetycompoundswereisolatedfromthefouractivestrainsbyrepeated
columnchromatographyonsilicagel,SephadexLH-20,preparativethinlayer
chromatographyPTLCandrecrystallization.Thestructuresofthese
compoundswereelucidatedbymeansofspectroscopicmethodsincluding
113
ESI-MS,HR-ESI-MS,1D-NMRHNMR,CNMR,DEPTand2D-NMR
11
H-HCOSY,HSQC,HMBCaswellaschemicalmethod.Amongthemthere
werethreenewcompounds,malforminE19,cyclo-N-methyl-Trp-Leu62
andhelovlicacidester83.
Thirty-fourcompoundswereisolatedfromfungusER12,andthechemical
structuretypesofcompoundswereinvolvedincyclicdipeptides3-10,13-16,
malforminE19,fumiquinazolines17,18,22,23,diphenylketones20,21,
imidazoles12,sterols1,2,benzenederivatives11,24-28,31,32and
nucleosides29,30,33,34.Eighteencompoundswereisolatedfromfungus
EL09,andthestructuretypesofcompoundswereinvolvedinsterols38-44,1,
2,fattyacids35-37,furanderivatives45,46,polyhydricalcohols47,48
andindolederivatives49,50.Twenty-twocompoundswereisolatedfrom
fungusFR02,andthestructuretypesofcompoundswereinvolvedinindolyl
diketopiperazineanalogs53-65,terpenes51,52,sterols1,39,
polycarboxylicacids67,68andpolyhydricalcohols66.Thirty-three
compoundswereisolatedfromfungusFl10,andthestructuretypesof
V
compoundswereinvolvedingliotoxins74-80,helvolicacidderivatives
81-83,cyclicdipeptides13,14,84,fattyacids69-71,36,37,sterols1,39,
72,73,benzenederivatives87-89,nucleosides29,30,85,86,polyhydric
alcoholsandpolycarboxylicacids47,48,68,90.
Ninetycompoundswereevaluatedfortheirantimicrobialactivitiesagains
eleventestedstrains.Theresultsindicatedthattwenty-sixcompoundsshowed
strongantimicrobialactivitiesandthestructuretypesofbioactivecompounds
wereinvolvedinindolyldiketopiperazines,gliotoxins,quinazolinealkaloids,
cyclicdipeptidesandsterols.Remarkably,malforminEandhelovlicacidester
showstrongantimicrobialactivitiesagainstdifferenttestedstrains.Theresultsof
antibacterialactivitytestindicatedbioactivesubstancesoffouractivefungi.
ActivesubstancesofER12weremainlyfumiquinazolinealkaloidsandcyclic
peptidecompounds.ActivesubstancesofEL09weresterolsandfurans.Active
substancesofFR02wereindolyldiketopiperazines.ActivesubstancesofFL10
weregliotoxinsandhelvolicacidderivatives.Threenewcompoundsandisolated
alkaloidswereevaluatedfortheircytotoxicitiesagainstthreecancercelllines,
MCF-7,HepG2andA549,bytheMTTmethod.Theresultsindicatedthatfourof
themshowedsignificantcytotoxicitiesagainstdifferentcancercelllinesand
others
升级会员 