线粒体功能障碍与人体疾病地研究的进展1221054219.docx
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线粒体功能障碍与人体疾病地研究的进展1221054219
兰州交通大学化学与生物工程学院
综合能力训练I文献综述
题目：
线粒体疾病的最新研究进展
作者：
朱刚刚
学号：
201207730
指导教师：
谢放
完成日期：
2014-7-16
线粒体疾病的最新研究进展
摘要：
本文为了对线粒体疾病研究的最新进展进行论述，分别从线粒体功能障碍、线粒体疾病、以及相关线粒体疾病的治疗与干预策略三个方面进行了综述。
重点从线粒体的功能障碍进行了介绍。
关键词：
线粒体、线粒体tDNA、线粒体疾病。
引言：
线粒体疾病主要是指由于线粒体DNA突变所导致的一类疾病。
有许多人类疾病的发生与线粒体功能缺陷相关，如线粒体肌病和脑肌病、线粒体眼病，老年性痴呆、帕金森病、O型糖尿病、心肌病及衰老等，有人统称为线粒体疾病。
线粒体疾病的发生被认为与氧化磷酸化过程相关基因的突变有关。
一、线粒体功能障碍
1线粒体结构、基因组特征及主要功能
1.1线粒体结构及基因组特征电镜下的线粒体是由两层单位膜套叠而
成的封闭囊状结构，从外向内依次分为外膜、膜间隙、内膜、基质。
不同于经典的“隔舱板”理论，最新提出的三维重构模型认为：
（1）外膜与内质网或细胞骨架连接形成网络；⑵内外膜间随机分布横跨两端，宽20nm的接触点；（3）内膜通过界面与嵴膜接口部分相连，并不直接向内延伸形成嵴膜；（4）嵴膜非“隔舱板”
式而是管状或扁平状，相互间可连接或融合，呈现不同的形式。
执行线粒体功能的生物大分子分布在不同的空间：
外膜上有Bcl-2家族蛋白、膜孔蛋白以及离子
通道蛋白；内膜中有电子传递链（呼吸链）复合物l~IV和复合物V（ATP合成酶）;
膜间隙和嵴膜腔分布着细胞色素C、凋亡诱导因子（apoptosisin-dueingfactor，AIF）和Procaspase2、3、9及其他酶蛋白；电压依赖性阴离子通道（VDAC）、ADP/ATP转换蛋白（ANT）和线粒体膜转运孔
（mitochondrialper-meabletransitionpore，MPTP）存在于接触点；三羧酸循
【1】
环（TCAcycle）酶系、存储钙离子的致密颗粒及线粒体基因组则包含于基质中与核基因组（nDNA）不同，mtDNA结构简单，仅含16569个碱基，编码2种rRNA、22种tRNA和13种参与呼吸链形成的多肽。
通常裸露且不含内含子，既缺乏组蛋白保护和完善的自我修复系统，又靠近内膜呼吸链，极易受环境影响，突变频率比nDNA高10~20倍。
1.2线粒体功能作为糖、脂肪、氨基酸最终氧化释能的场所，线粒体的主
要功能是进行氧化磷酸化、合成ATP，为生命活动提供直接能量。
除此以外，它还扮演着多种角色，其中之一是充当“钙库”，参与细胞内钙离子的信号传导。
研究发现，一旦感受到周围形成的钙微区（calciummicrodomain），线粒体可以利用呼吸代谢时产生的电化学梯度，通过膜上协同转运体将钙摄入基质，然后以磷酸钙的形式储存在一些较大的致密颗粒中。
【2】已经积累的Ca2+又可以通过
钠—钙交换系统（2Na+/Ca2+exchanger，NCE）和大分子MPTP转运孔道再次
释放到胞质，从而调节胞浆中钙离子的动态平衡，影响细胞内许多相关的生理活
动，如信号传导、能量代谢和细胞凋亡。
线粒体参与了细胞凋亡。
研究发现，在典型的凋亡特征，如染色质浓缩、DNA碎片（DNAladder）、凋亡小体等出
现以前，线粒体已经发生跨膜电位丧失、外膜通透性增加、膜间隙蛋白释放等重
大变化。
细胞色素C是诱发凋亡的重要信号分子，它是相对分子量为1.45X104Da的水溶性蛋白，一般分散在膜间隙靠近内膜面，不能通过外膜。
凋亡发生时释放到胞质，在ATP/dATP的参与下，与Apaf-1（apoptoticproteaseactivatingfactors）
结合形成寡聚体（Apoptosome）,Apaf-1再通过其氨基端与Caspase-9的功能前端相互作用，导致Caspase-3活化并进一步激活下游的Caspases。
此外，还有一种不依赖于Caspase的凋亡诱导因子（AIF），是分子量为5.7X104Da的黄素蛋白，与细菌铁氧还原蛋白和NADH氧化还原酶有高度同源性，释放后可
直接到达细胞核，激活核酸内切酶，引发凋亡。
【3】目前认为，Bcl-2家族蛋白
的调控与MPTP孔道的开放，是造成外膜非特异性断裂、通透性增高、凋亡因子释放的主要原因，而氧自由基积聚、氧化应激产生，可能直接参与并诱导了的下降和MPTP的开启，是构成凋亡信号传导的早期事件。
线粒体既是自由基的攻击靶点，也是自由基的产生源头。
胞内95%以上的活性氧（reactive
oxygenspecies，ROS）来自线粒体氧化磷酸化，是分子氧接收呼吸链“漏电子”后还原形成的副产物，包括超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢。
它们中20%来
自复合体I，80%来自复合体III，大致占呼吸态IV总耗氧量的2%~6%，极易诱发氧化应激，造成细胞损伤。
不过，由于具有完善的抗氧化防御体系，细胞内多余的ROS总能及时被清除。
已知的抗氧化系统分为酶性和非酶性两种，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（Catalase）以及谷胱甘肽（GSH）、抗坏血酸、亲水性（疏水性）抗氧化物质等。
正是依赖这样的防御措施，体内自由基的。
【4】
2、线粒体DNA（mtDNA）缺陷
2.1线粒体DNA（mtDNA）缺陷、氧化磷酸化异常及能量代谢障碍，通常能引起细胞结构、功能发生一系列渐进性，甚至不可逆性的病理改变，在脑组织中影响尤为明显，因为大脑虽然重量仅占身体总重的2%，但对氧的消耗量却要占到身
体总消耗量的25%哺乳动物mttRNA有3种常见的非典型二级结构（Fig.1）绝大多数tRNA具有高度保守的三叶草结构（Fig.1A，0型）【5】.在环
和螺旋线平面间的一些相互作用下形成tRNA的三级结构即L折叠，比如T
WC环（T环）和二氢尿嘧啶环（D环）.1980年mtDNA测序发现，人类和牛科动物mttRNASer（AGY）（丫=U和C）没有完整的D环结构
（Fig.1D,111型）.生化研究发现，mttRNASer（AGY）能氨酰化，而且在体外具有翻译活性.进一步的晶体结构分析发现，其核心结构区的弹性比0型结
构大.在核糖体上，反密码子环和3'CCA末端之间存在约78度的类飞镖结构；由于D环的G18和G19以及T环的U55和C56均不保守，导致II型tRNA缺乏典型的D环和T环间的相互作用（Fig.1C，II型）.对tRNAPhe和mttRNAAsp的化学检测发现，D环和T环间相互作用微弱，但在D茎存在典型的三级作用，形成稳定的核心；对mttRNA结构进行深入研究发现。
【6】
tRNASer（UCN）同样具有不典型的三叶草结构（Fig.1B，I型）.其结构特征如下：
接受臂和D环间只有个腺苷酸；D环缩短；额外多1个环.化学检测和电脑模拟结果显示，D环或其它环核心区的多个缺失能通过增加反密码子螺旋区的碱基对（27a〜43a）来弥补，从而维持类L型的结构mtDNA处于氧自由基的包围之中，缺乏组蛋白的保护，由于线粒体缺乏DNA损伤修复
系统，突变率是核DNA的10〜20倍.选择压力在核基因中淘汰了许多突变，而在线粒体中这种压力被松弛，由线粒体编码的蛋白质和RNA突变后，
对个体的适应性比核编码的高.【7】由此造成哺乳动物mtDNA进化速率增快（约为核DNA的5〜10倍），可能是mttRNA序列和结构多态性的主要原因之一.
2.2mtDNA译码系统
遗传密码几乎是通用的，但是有极少数的例外.哺乳动物线粒体AUA、UGA、AGR（R=A和G）分别翻译为Met、Trp和终止密码子（这与通常的译码
不同，Table1）.多数已鉴定的密码变化发生在线粒体中，而密码的改变会对细胞蛋白质发生致命性的影响，由于线粒体有自己的tRNA，密码的改变不影
响细胞基因组.【8】相反，在线粒体中，这种改变可以看做是一种基因组的精简.最初的译码准则是密码子第3位的U只能被A和G识别，然而U34的构象灵活多变，它与4种碱基都能配对（Crick称其为变偶性）.无修饰的U通过变偶配对降低了人类mttRNA的种类（Table1）.仅22种mttRNA即可翻译60个有意义的密码子，这也是翻译有意义的密码子最少的一组tR
NA.终止因子mtRF1a识别终止密码子UAA和UAG.mRNACO1和ND6的终止密码子分别是AGA和AGG.因为两者都没有相应的tRNA和释放因子，长期以来AGR一直作为它们的终止密码子，但这个机制并不清楚.近年发现，哺乳动物mtRFla通过在AGR密码子后移一个读码框架来识别终止密码子。
【9】
二、线粒体疾病。
1、线粒体疾病的分类
线粒体疾病主要分为两大类：
遗传性和获得性疾病，前者病因包括核DNA损害、线粒体DNA损害和基因组间的通讯障碍，后者主要由毒素、药物和衰老引起。
目前的主要研究集中于线粒体DNA突变与线粒体疾病临床表型的相互关系上。
目前人们所认识的线粒体疾病主要是一些神经肌肉变性疾病，如Leber's遗传性视
神经病，线粒体脑肌病，帕金森氏病，阿尔茨海默病，母系遗传的糖尿病和耳聋等。
根据mtDNA突变的性质可以将其分为两种主要类型，即碱基替换突变和插入一缺失突变。
碱基替换发生的位置不同，引起的突变效果也不同。
发生在白质基因上的碱基替换可以导致错义突变，进而影响蛋白质的功能。
发生在tRNA和rRNA基因上的碱基替换可以影响tRNA和rRNA的结构,导致蛋白质合成障碍。
［10］缺失一插入突变是指mtDNA在复制分离过程中发生了碱基序列的丢失或插入，其中以缺失突变较为常见。
大片段的缺失多发生在两个同向重复序列之间。
最常见
的缺失突变是4977bp缺失，约50%的4977bp缺失发生在8470〜13447区域两个13bp的同向重复序列（5'-AC-CTCCCTCACCA）之间。
还有一较为常见的缺失是7436bp缺失，常发生在8637〜16073区域两个12bp的同向重复序列。
【11】（5-CATCAA-CAACCG）之间。
大片段的缺失往往涉及多个基因，最终导致线粒体OXPHOS功能下降，产生的ATP减少,从而影响组织器官的功能。
mtDNA突变导致的OXPHOS缺陷的严重性是由突变mtDNA的性质及其在细胞中所占的比例决定的，而突变mtDNA的表型又与OX-PHOS缺陷的严重性及各个组织器官的能量阈值有关。
中枢神经系统及肌肉组织对ATP的需求量大，因此最易受累，
其它象心脏、肾脏、肝脏以及胰岛组织对OXPHOS缺陷也较敏感，故也常常出现这些组织器官的变性疾病。
【12】
2.线粒体脑肌病
ME是一组由于线粒体功能缺陷造成的以神经肌肉系统病变为主的多系统疾病。
根据临床表现可分为伴有破碎红纤维的肌阵挛癫痫（MERRF），伴高乳酸血症中风样发作的线粒全脑肌病（MELAS）,Kearns-sayre综合征（KSS）慢性进行性眼外肌瘫痪（CPEO）,神经源性肌软弱病、共济失调并发色素性视网膜炎（NAPP）等。
（1）MERRFMERRF是一种母系遗传病，主要表现为阵发性癫痫、骨骼肌不自主痉挛伴破碎性红肌纤维病、全身性抽搐和小脑共济失调等。
【131通常在10〜20岁发病，晚期可出现精神异常。
1988年Wallace等［7］发现MERRF患者神经症状严重程度和呼吸链中NADH脱氢酶、细胞色素C氧化酶活性降低程度均与
OXPHOS缺陷相关，后来发现MERRF家系中存在一个mtDNA的8344A—G的碱基置换，该突变位于mtDNA的tRNAlys基因上，涉及到tRNAlys的TUC环，此环参与tRNA与核糖体的连接，结果影响线粒体蛋白质的合成（主要是影响OX-PHOS复合体I和W的合成）,造成OXPHOS的功能下降，最终导致MERRF的多系统病变。
【1318344点突变产生了一个新的CviJI酶切位点,可用于此病的诊断。
⑵MELASMELAS是一种不常见的母系遗传病，通常在10〜20岁发病,主要临床表现为中风样发作、血乳酸中毒、近心端四肢乏力、间断性呕吐等。
【1511990年Goto等首次发现了MELAS患者中普遍存在有mtDNA3243A—G突变目前认为3243A—G突变是MELAS的主要致病因素。
该突变使tRNAleu基因发生突变，导致16SrRNA的合成减少，最终影响线粒体内蛋白质的合成。
其它与之有关的突变有mtD-NA11084A—G突变和3771突变。
Salvatore等报道,在血液中突变的比肌肉组织少，且在某些病例的血液中未发现有mtDNA突变，提示在MELAS突变检测血细胞是可行的，但不是绝对可靠的诊断依据。
（3）KSS和CPEO临床上以眼外肌麻痹伴有四肢乏力为主要症状者称为CPEO。
当伴有色
素性视网膜炎、听力丧失、心脏传导功能障。
【161
三、相关线粒体疾病的治疗与干预策略
1、线粒体疾病是指线粒体基因组和核基因组突变导致氧化磷酸化
功能缺陷而引起的疾病。
异质性mtDNA突变致病的阈值水平相对较高，大多在80%~90%，所以只要降低受累组织的突变负荷就可以达到治疗效果即通过将突变型mtDNA转变成
野生型mtDNA。
这样不仅使突变的mtDNA比率选择性地下降，而且野生型mtDNA的比率也可以升高。
【171线粒体靶向限制性内切酶改变突变异质性限精彩文档
制性内切酶（restrictionenzyme,RE）能在特异性限制位点选择性地剪切DNA
双链。
某些mtDNA突变会产生一个新的限制性酶切位点，线粒体靶向RE可以识别这个位点，并对突变的mtDNA进行降解，使得剩余的野生型mtDNA比率相对升高，从而降低细胞中突变mtDNA的比例，造成异质程度改变。
线粒
体靶向RE最初用于异源线粒体的杂合细胞。
【18】因大鼠mtDNA缺乏PstI位点，线粒体PstIRE（mito-PstI）的表达能够改变同时含有小鼠和大鼠融合细胞的mtDNA异质性。
含两种鼠类mtDNA单体型（BALB和NZB）的无症状小鼠模型的体外和体内试验表明，用重组病毒载体定位于线粒体的REs表达可以有
效地改变mtDNA异质性。
【19】这两种mtDNA单体型能够通过REApaLI区分，它能识别BALBmtDNA的一个位点，而不能识别NZBmtDNA中的位点。
正因为只有BALBmtDNA突变体含有ApaLI特异性酶切位点，异质小鼠局部注射编码线粒体靶向ApaLIRE（mito-ApaLI）的重组腺病毒后，肌肉和脑部显
示快速、定向且彻底的mtDNA异质性改变。
mtDNA异质性改变的程度和效率依赖于未被剪切的mtDNA数量。
【20】因为ApaLI只剪切BALBmtDNA，余下的NZBmtDNA继续复制以维持正常mtDNA拷贝数，因此没有观察到明显的mtDNA耗损。
线粒体靶向REs可以作为异质性改变的策略，但是主要的局限是合适的限制性位点的临床相关突变极少。
2、蛋白质转导/蛋白质转染
由于mtDNA编码的线粒体蛋白是疏水性的，这给外源蛋白的导入带来一定的难度，蛋白质转导则是一种忽略蛋白质自身特性的新型导入方法，有细胞渗透性
质的蛋白质转导结构域的发现为克服上述问题提供了可能性。
最常用的蛋白质转
导结构域是TAT,它是HIV上较大的短阳性肽，能够穿过细胞膜。
⑵】TAT融合蛋白耦合细胞核定位信号（nuclearlocalizationsignal,NLS）或线粒体靶向
序列（mitochondrialtargetingsequenee,MTS）能够转导进入细胞并定位保
留在亚细胞相应区域。
线粒体成功靶向导入的报道见于TAT介导的硫辛酰胺脱氢（lipoamidedehydrogenase,LAD），利用固有的MTS恢复了LAD缺陷患
者细胞内线粒体丙酮酸脱氢酶复合体的活性。
122】蛋白质转导的优势在于跨膜
转运不依赖TIM和TOM复合体，而劣势在于这是一种短暂的修复作用。
3、清除核苷
线粒体神经胃肠型脑肌病（mitochondrialgastr-ointestinalencephalopathy,MNGIE）属多系统疾病，患者常表现为严重的胃肠道功能障碍伴外周神经变性及脑白质异常等，主要由胸腺磷酸化酶（thymidinephosphorylase,TP）缺陷
导致。
【23】TP活力降低可引起血液中脱氧胸苷和脱氧尿苷水平上升。
目前，清除血液中的核苷有三个方法：
血液透析、异源干细胞移植和血小板灌注。
四、展望
近年来科学水平飞速发展，各个科学领域都取得了重大突破，生命科学领域尤为突出，故而在线粒体疾病研究方面可能会在近十年取得重大突破，对线粒体结构及其内部酶的结构研究，将会对人类未来生命科学做出巨大贡献。
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