从纯化到星辰.docx

从纯化到星辰.docx

《从纯化到星辰.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《从纯化到星辰.docx（24页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

从纯化到星辰

纯化到星辰

Royluo

本文献给YL

引子　

2000年5月6日，我一个人在合肥三孝口书店闲诳,希望买点参考书带出国去。

我注意到有一本翻译过来的书，书名叫做《蛋白质纯化与鉴定实验指南》。

这本书很奇怪，里面列出了很多具体实验的步骤和解释。

我很快意识到，这本书实际上是冷泉港实验室开设的一门《蛋白质纯化与鉴定》实验课的教材。

这本书深深的吸引了我，因为里面记录的实验十分经典，涵盖了蛋白质纯化中可能用到的大部分手段，并且对实验细节有十分详尽的解释。

我对这本书爱不释手，于是就买了下来,而且当时就动了上这门课的念头。

这是一个很模糊的想法，没有想到的是，五年以后这个想法竟然实现了。

这一系列文章是我对这次上课经历的全面总结，一部分是八卦，一部分是流水账般的记叙，还有一些是从这课程学到的tricks,最后也掺杂着自己过去做蛋白质纯化的心得。

想到哪说到哪，文字挺松散的，见笑了。

我来解释一下标题。

课程结束之后，每一个学员都有一份证书，印着PerPuraAdAstra几个大字。

这是拉丁语，直译就是“从纯化到星辰”。

原始的谚语是,PerAsperaAdAstra,意思是throughsufferingtorenown。

所以“从纯化到星辰”实际的意思是，做好蛋白质纯化，以后就容易出人头地。

呵呵。

（二）同学和老师

　冷泉港的《蛋白质纯化与鉴定》培训班历史相当悠久，从1989年开始每年都开课，到今年是第十六次。

每年都是四月初开始，持续两个星期。

值得一提的是，冷泉港有相当多的培训班和会议，是一个科学家交流和学习的中心。

这是冷泉港享有盛名的最主要原因。

　2004年底,我下定决心上这门课，于是递交了申请。

二月份的时候的到消息，我被录取了，并且还有1000刀的tuitionwaiver。

可我还是高兴不起来，因为还得解决1600刀（学费一共2600刀）。

老板人很nice,但是他实在没钱了，所以我只好咬咬牙自己套腰包解决了，去年的退税就这样全搭进去了,欲哭无泪啊。

　四月五号下午我赶到冷泉港，办完登记手续后被告知晚上七点全体开会，与教员和同学见面。

老师一共有四个，每人负责一个模块的实验，持续三天时间,每个老师都有一两个助手帮忙。

学生则一共有16个，分成四组，轮转式的做完四个模块。

我这一组其他三个人是:

来自coloradoBoulder的chad,做有丝分裂的;来自Princeton的Adam,做海洋生物学的。

Chad和Adam都是博士后。

第三个是来自丹麦的Charlotte，是个博士生，做植物的。

现在开始八卦一下几个老师，^_^总负责人是来自wisconsin-madison的RichardBurgess教授,这老头很有意思，带这个培训班已经带了十二年了，到现在还是乐此不疲。

他六十年代是watson的博士后，watson似乎跟他关系很好，每年纯化课的时候，watson都会跑到培训班的实验室找Burgess聊天，同时拉他去吃饭什么的。

后来的有一天，我还真的看到了watson去找他聊天。

不过令人惊讶的是，watson此人相当精神，走路象年轻人。

watson此人口碑很不好，很自大。

连Burgess教授一次和我们吃饭的时候都承认，watson有时候口无遮拦，让他都觉得很难堪。

但是Burgess又承认watson对他自己的学生很支持，很提拔，这几年又尽心尽力为冷泉港筹款，贡献巨大。

　第二位教员是来自UCLA的AlbertCourey教授。

这位教授人很nice也很幽默，四位老师中我对他印象最好。

申请这个课前，我先跟他发过e-mail询问这个课的情况，而他也鼓励我申请。

这老哥研究果蝇的,但是他却负责教一组纯化转录因子的实验。

我一开始不太理解，后来问他的学术经历，才明白是怎么回事。

原来这老哥博士是做生化，博后跟的是robertTjian（钱泽南），还是做生化，研究转录因子。

后来做了faculty之后，决定用果蝇做模型来研究转录因子。

他那时侯不懂果蝇的遗传学，完全靠自学和到处问人。

我知道后觉得特佩服，真正的科学家不应该被自己过去所受的训练束缚死了，应该是根据研究的需要随时准备学习新东西。

这老哥虽然不是最年轻的，但是却很能跟上年轻人的潮流，比如他说他有一个ipodmini,还在网上itunes商店买过歌。

我还跟他就ipod聊了一阵子，因为我也有个ipod。

第三位教员是来自TexasMDandersoncancercenter的sue-hwalin教授。

她是一个身材瘦小的中年妇女，台湾人，特搞笑，非常喜欢给我们讲她博士后老板的笑话。

一个笑话是这样的,有一天有一个学生向这个老兄投诉说和实验室另一人有矛盾。

这个老兄想了想，然后一本正经的说，和人产生矛盾了，一般有三种选择。

第一种呢，就是既然你恨他，那就杀了他好了。

那个学生听了之后，差点倒了。

这个老兄说看起来你丫没这胆量，那还有第二种选择，就是杀了你自己。

那个学生听了几乎要吐血。

这老兄一看乐了，然后说你既然没种杀人或者自杀，就剩第三种选择了,就是ignorethatguy!

!

!

哈。

还有另一个笑话，sue-hwalin的

博士后老板虽然当了老板，但是还是喜欢做实验，并且和一个博后共用一个bench。

有一天那个博后指着这老兄的鼻子说，XXX呀，你把bench弄得太乱了，赶快给我清理干净了。

这老兄听了之后也不怒，而是慢条斯理的辩解说，每个人都有自己喜欢的工作方式，我喜欢乱，你丫管我呢，要是不喜欢，我们可以在bench上画条线划清界线，从此井水不犯河水。

哈哈哈。

这老美连三八线都出来了。

第四位教授是rutgersuniversity的konstantinSeverinov副教授，这老兄是俄罗斯人，这四位老师中最年轻的一位。

此君满头乱发，一脸大胡子，看起来很邋遢，所以一开始我对他印象不佳。

后来发现此人相当nice。

Konstantin特搞，有一次他做报告，他的电脑的桌面上有一堆乱七八糟的文件夹，其中有一个竟然是divorce!

我告诉坐我旁边的一个老美，老美说也注意到了，认为实在是很sad，呵呵。

另外，他有两个未成年的儿子，喜欢不断打他手机。

结果他常常讲实验讲到一半就得停下来接电话。

这个课结束之后，他还跑到冷泉港书店买了一堆虫子毛绒玩具给两个儿子做纪念品。

舔犊情深，可见一斑。

（三）不溶的sigma32

　　四月六号早上，我们开始了第一模块的实验，Burgess教授负责。

这老兄研究了一辈子E.Coli的RNA　polymerase。

E.ColiRNApolymerase核心酶是一个蛋白质复合体，只有合成RNA的活性，却没有识别DNA的能力。

Sigma系列因子能够识别启动子,并且与核心酶结合，从而实现转录。

我们这个实验

的核心主角就是其中一个因子，叫sigma32。

Sigma32可以识别heatshockgenes的启动子。

Sigma32过表达在大肠杆菌里面的时候，绝大部分形成了不溶的包涵体（inclusionbody）,我们的任务就是要用变性剂溶解变性不溶的蛋白，然后做重折叠。

所有的buffer几乎都已经配好了，所以直接做就行了。

我们先用1%Triton来溶解细菌本身的一些蛋白，inclusionbody相当稳定，不溶于triton,所以这一步，绝大部分垃圾就被去掉了。

下一步就是用变性剂来溶解inclusionbody。

用什么好呢？

Burgess教授提到了

sarkosyl。

sarkosyl（N十二烷基肌氨酸钠）是一种比较强的阴离子去垢剂,0.3%的浓度就可以让包涵体溶解。

sarkosyl的优点是，虽然在高浓度下有变性作用，低浓度下却对蛋白质有稳定的作用。

所以用sarkosyl做重折叠之前的变性剂是再好也不过的了。

　Burgess还要我们试了经典的GudnHCl（盐酸胍）来变性，作为对比。

inclusionbody在这两种变性剂下很容易就溶解了。

然后我们得去掉变性剂，做重折叠。

怎么做呢？

方法有很多种，最简单的是透析，把变性剂全部换掉。

这个方法Burgess并不喜欢，因为，透析是个缓慢的过程。

在透析袋里面，蛋白的浓度还是很高。

折叠中间产物容易相互接触形成不溶的聚合物。

另一种方法是突然稀释变性的蛋白，由于蛋白浓度相对与透析低了很多，好一点。

但是问题也是类似的。

Burgess提议用逐步滴加稀释的办法。

就是放一大烧杯的缓冲液，里面有一个磁石可以不断混合液体，然后一滴一滴加入变性的蛋白溶液。

由于烧杯里的溶液蛋白量是逐渐增加的，所以一开始蛋白折叠中间产物能够相互作用的几率大大降低了。

Burgess说的还真象那么回事，可事实上，嘿嘿。

我们先用试着重折叠GudnHCl溶解的Sigma32。

一开始还好，滴到后来，溶液就变浑浊了，最后几乎成了冲淡了的牛奶那样的东东。

Burgess脸色不好看，说不应该这样的。

我们一离心，沉淀出来一大堆不溶解的蛋白。

剩下的上清跑了一个PorosHQ50阴离子交换柱，拿到的蛋白很少，回收率小于5%。

失败啊。

　从这里开始，我要岔开一下，讲一些跟这个模块实验没太大关系，但是很有意思的东西。

（四）Hydrostaticpressure和跑小柱子的trick

　　Dr.Burgess假定我们对蛋白质纯化一无所知，所以讲得很细致。

比如他特别提到了disposablecolumn的用法。

这种小柱子很简单，把beads倒进去，冲洗一下就可以用来纯化蛋白了，很方便。

唯一的问题是，由于是依靠重力跑，速度有时候会十分慢。

液体流经柱子速度由hydrostaticpressure（静流体压力）来决定。

而hydrostaticpressure又是由实际柱高（即液体经过的长度）来决定。

如果你嫌液体流得太慢（尤其是洗柱子的时候），可以在柱子下端出口连一个长的塑胶管子或者针管，这样速

度会快很多。

这是很简单的小trick,但我觉得对初做蛋白质纯化的人还是很有帮助的。

　　我知道一个例子。

我原来很喜欢女生A,有一天晚上主动等在她实验室等她做完实验，就开车送她回家。

这一等不得了，从晚上七点等到了凌晨一点。

这个过程中，她好像没什么事情，但是每隔20分钟，她就会去一次coldroom。

作完实验了之后，我好奇的问她，到底是什么试验花了这么长时间，结果她说她在用一个disposablecolumn纯化蛋白，由于beads稍微多了一点，速度很慢，而protocol有一步要求用数百毫升的洗液来冲洗柱子。

所以她每隔二十分钟就去加洗液，所以白白花了好几个小时。

我听了之后都要ft了,没想到她们实验室竟然没有人告诉她,有简单的办法可以让柱子跑得快一点的。

只要在下端出口加一个长管子，她至少可以少等两个小时。

当然最简单的办法还不是这个，最简单的办法的是把盛有洗液的容器放高，然后利用虹吸的原理让液体源源不断的流经柱子。

同时，柱子的下端连上塑胶管，弯成一个连通器，这个连通器的高度应该略高于柱面，这样冲洗结束后，柱子就不会干。

如果用这种方法，A就不用在实验室待一晚上了，因为一切都是自动完成的。

　我现在跟A已经完全没有来往了,但我对她映象还是十分深刻，主要就是因为她那晚跑柱子的经历。

话撤远了，现在再回到蛋百质纯化课。

（五）"万金油"buffer

　Dr.Burgess这人特有意思，喜欢吹嘘他发现的小trick。

比如，他得意说他是全美国最早用coomassieblue染蛋白胶的人。

据他说，六几年的时候他看到一个澳洲的老兄的一片文章,讲述一种新奇的染料叫考马市亮蓝,比当时流行的染料amidoblack灵敏十倍以上。

所以他就写了一封信要了一些，结果效果奇好。

我们听得都目瞪口呆。

　不过Burgess最自豪的，还是他的“万金油”buffer。

他告诉我们说，他几十年了，总喜欢用这个buffer的配方，什么蛋白都喜欢这种