从纯化到星辰.docx

1、从纯化到星辰纯化到星辰Royluo本文献给YL引子 2000年5月6日，我一个人在合肥三孝口书店闲诳,希望买点参考书带出国去。我注意到有一本翻译过来的书，书名叫做蛋白质纯化与鉴定实验指南。这本书很奇怪，里面列出了很多具体实验的步骤和解释。我很快意识到，这本书实际上是冷泉港实验室开设的一门蛋白质纯化与鉴定实验课的教材。这本书深深的吸引了我，因为里面记录的实验十分经典，涵盖了蛋白质纯化中可能用到的大部分手段，并且对实验细节有十分详尽的解释。我对这本书爱不释手，于是就买了下来, 而且当时就动了上这门课的念头。这是一个很模糊的想法，没有想到的是，五年以后这个想法竟然实现了。 这一系列文章是我对这次上课

2、经历的全面总结，一部分是八卦，一部分是流水账般的记叙，还有一些是从这课程学到的tricks, 最后也掺杂着自己过去做蛋白质纯化的心得。想到哪说到哪，文字挺松散的，见笑了。 我来解释一下标题。课程结束之后，每一个学员都有一份证书，印着Per Pura Ad Astra 几个大字。这是拉丁语，直译就是“从纯化到星辰”。原始的谚语是,Per Aspera Ad Astra, 意思是through suffering torenown。所以“从纯化到星辰”实际的意思是，做好蛋白质纯化，以后就容易出人头地。呵呵。 （二）同学和老师 冷泉港的蛋白质纯化与鉴定培训班历史相当悠久，从1989年开始每年都开课，

3、到今年是第十六次。每年都是四月初开始，持续两个星期。值得一提的是，冷泉港有相当多的培训班和会议，是一个科学家交流和学习的中心。这是冷泉港享有盛名的最主要原因。 2004年底, 我下定决心上这门课，于是递交了申请。二月份的时候的到消息，我被录取了，并且还有1000刀的tuition waiver。可我还是高兴不起来，因为还得解决1600刀(学费一共2600刀)。老板人很nice,但是他实在没钱了，所以我只好咬咬牙自己套腰包解决了，去年的退税就这样全搭进去了, 欲哭无泪啊。 四月五号下午我赶到冷泉港，办完登记手续后被告知晚上七点全体开会，与教员和同学见面。老师一共有四个，每人负责一个模块的实验，持

4、续三天时间, 每个老师都有一两个助手帮忙。学生则一共有16个，分成四组，轮转式的做完四个模块。我这一组其他三个人是:来自colorado Boulder 的chad,做有丝分裂的;来自Princeton的Adam,做海洋生物学的。Chad和Adam都是博士后。第三个是来自丹麦的Charlotte，是个博士生，做植物的。 现在开始八卦一下几个老师，_ 总负责人是来自wisconsin-madison的Richard Burgess教授, 这老头很有意思，带这个培训班已经带了十二年了，到现在还是乐此不疲。他六十年代是watson的博士后，watson似乎跟他关系很好，每年纯化课的时候，watson

5、都会跑到培训班的实验室找Burgess聊天，同时拉他去吃饭什么的。后来的有一天，我还真的看到了watson去找他聊天。不过令人惊讶的是，watson此人相当精神，走路象年轻人。watson此人口碑很不好，很自大。连Burgess教授一次和我们吃饭的时候都承认，watson有时候口无遮拦，让他都觉得很难堪。但是Burgess又承认watson对他自己的学生很支持，很提拔，这几年又尽心尽力为冷泉港筹 款，贡献巨大。 第二位教员是来自UCLA 的Albert Courey 教授。这位教授人很nice也很幽默，四位老师中我对他印象 最好。申请这个课前，我先跟他发过e-mail 询问这个课的情况，而他也

6、鼓励我申请。这老哥研究果蝇的, 但是他却负责教一组纯化转录因子的实验。我一开始不太理解，后来问他的学术经历，才明白是怎么回事。原来这老哥博士是做生化，博后跟的是robert Tjian （钱泽南），还是做生化，研究转录因子。后来做了faculty之后，决定用果蝇做模型来研究转录因子。他那时侯不懂果蝇的遗传学，完全靠自学和到处问人。我知道后觉得特佩服，真正的科学家不应该被自己过去所受的训练束缚死了，应该是根据研究的需要随时准备学习新东西。这老哥虽然不是最年轻的，但是却很能跟上年轻人的潮流，比如他说他有一个ipod mini,还在网上itunes商店买过歌。我还跟他就ipod聊了一阵子，因为我也有

7、个ipod。 第三位教员是来自Texas MD anderson cancer center的sue-hwa lin教授。她是一个身材瘦小的中年妇女，台湾人，特搞笑，非常喜欢给我们讲她博士后老板的笑话。一个笑话是这样的, 有一天有一个学生向这个老兄投诉说和实验室另一人有矛盾。这个老兄想了想，然后一本正经的说，和人产生矛盾了，一般有三种选择。第一种呢，就是既然你恨他，那就杀了他好了。那个学生听了之后，差点倒了。这个老兄说看起来你丫没这胆量，那还有第二种选择，就是杀了你自己。那个学生听了几乎要吐血。这老兄一看乐了，然后说你既然没种杀人或者自杀，就剩第三种选择了, 就是ignore that guy

8、!哈。还有另一个笑话，sue-hwa lin的 博士后老板虽然当了老板，但是还是喜欢做实验，并且和一个博后共用一个bench。有一天那个博后指着这老兄的鼻子说，XXX呀，你把bench弄得太乱了，赶快给我清理干净了。这老兄听了之后也不怒，而是慢条斯理的辩解说，每个人都有自己喜欢的工作方式，我喜欢乱，你丫管我呢，要是不喜欢，我们可以在bench上画条线划清界线，从此井水不犯河水。哈哈哈。这老美连三八线都出来了。 第四位教授是rutgers university 的konstantin Severinov副教授，这老兄是俄罗斯人，这四位老师中最年轻的一位。此君满头乱发，一脸大胡子，看起来很邋遢，所

9、以一开始我对他印象不佳。后来发现此人相当nice。Konstantin特搞，有一次他做报告，他的电脑的桌面上有一堆乱七八糟的文件夹，其中有一个竟然是divorce!我告诉坐我旁边的一个老美，老美说也注意到了，认为实在是很sad，呵呵。另外，他有两个未成年的儿子，喜欢不断打他手机。结果他常常讲实验讲到一半就得停下来接电话。这个课结束之后，他还跑到冷泉港书店买了一堆虫子毛绒玩具给两个儿子做纪念品。舔犊情深，可见一斑。（三） 不溶的sigma32 四月六号早上，我们开始了第一模块的实验，Burgess教授负责。这老兄研究了一辈子E.Coli的RNApolymerase。E.Coli RNA poly

10、merase 核心酶是一个蛋白质复合体，只有合成RNA的活性，却没有识别DNA的能力。Sigma系列因子能够识别启动子, 并且与核心酶结合，从而实现转录。我们这个实验 的核心主角就是其中一个因子，叫sigma32。Sigma32可以识别heat shock genes的启动子。Sigma 32过表达在大肠杆菌里面的时候，绝大部分形成了不溶的包涵体(inclusion body),我们的任务就是要用变性 剂溶解变性不溶的蛋白，然后做重折叠。 所有的buffer几乎都已经配好了，所以直接做就行了。我们先用1% Triton 来溶解细菌本身的一些蛋白，inclusion body 相当稳定，不溶于t

11、riton,所以这一步，绝大部分垃圾就被去掉了。 下一步就是用变性剂来溶解inclusion body。用什么好呢？Burgess教授提到了sarkosyl。sarkosyl(N十二烷基肌氨酸钠）是一种比较强的阴离子去垢剂, 0.3%的浓度就可以让包涵体溶解。sarkosyl的优点是，虽然在高浓度下有变性作用，低浓度下却对蛋白质有稳定的作用。所以用sarkosyl做重折叠之前的变性剂是再好也不过的了。 Burgess还要我们试了经典的 Gudn HCl（盐酸胍)来变性，作为对比。inclusion body 在这两种变性剂下很容易就溶解了。然后我们得去掉变性剂，做重折叠。怎么做呢？方法有很多种

12、，最简单的是透析，把变性剂全部换掉。这个方法Burgess并不喜欢，因为，透析是个缓慢的过程。在透析袋里面，蛋白的浓度还是很高。折叠中间产物容易相互接触形成不溶的聚合物。另一种方法是突然稀释变性的蛋白，由于蛋白浓度相对与透析低了很多，好一点。但是问题也是类似的。Burgess提议用逐步滴加稀释的办法。就是放一大烧杯的缓冲液，里面有一个磁石可以不断混合液体，然后一滴一滴加入变性的蛋白溶液。由于烧杯里的溶液蛋白量是逐渐增加的，所以一开始蛋白折叠中间产物能够相互作用的几率大大降低了。Burgess说的还真象那么回事，可事实上，嘿嘿。我们先用试着重折叠Gudn HCl溶解的Sigma32。一开始还好，

13、滴到后来，溶液就变浑浊了，最后几乎成了冲淡了的牛奶那样的东东。Burgess脸色不好看，说不应该这样的。我们一离心，沉淀出来一大堆不溶解的蛋白。剩下的上清跑了一个Poros HQ 50阴离子交换柱，拿到的蛋白很少，回收率小于5%。失败啊。 从这里开始，我要岔开一下，讲一些跟这个模块实验没太大关系，但是很有意思的东西。（四）Hydrostatic pressure和跑小柱子的trick Dr. Burgess 假定我们对蛋白质纯化一无所知，所以讲得很细致。比如他特别提到了disposable column的用法。这种小柱子很简单，把beads倒进去，冲洗一下就可以用来纯化蛋白了，很方便。唯一的问

14、题是，由于是依靠重力跑，速度有时候会十分慢。液体流经柱子速度由hydrostatic pressure(静流体压力）来决定。而hydrostatic pressure又是由实际柱高(即液体经过的长度)来决定。如果你嫌液体流得太慢（尤其是洗柱子的时候），可以在柱子下端出口连一个长的塑胶管子或者针管，这样速 度会快很多。这是很简单的小trick, 但我觉得对初做蛋白质纯化的人还是很有帮助的。 我知道一个例子。我原来很喜欢女生A, 有一天晚上主动等在她实验室等她做完实验，就开车送她回家。这一等不得了，从晚上七点等到了凌晨一点。这个过程中，她好像没什么事情，但是每隔20分钟，她就会去一次cold ro

15、om。作完实验了之后，我好奇的问她，到底是什么试验花了这么长时间，结果她说她在用一个disposable column纯化蛋白，由于beads 稍微多了一点，速度很慢，而protocol有一步要求用数百毫升的洗液来冲洗柱子。所以她每隔二十分钟就去加洗液，所以白白花了好几个小时。我听了之后都要ft了,没想到她们实验室竟然没有人告诉她, 有简单的办法可以让柱子跑得快一点的。只要在下端出口加一个长管子，她至少可以少等两个小时。 当然最简单的办法还不是这个，最简单的办法的是把盛有洗液的容器放高，然后利用虹吸的原理让液体源源不断的流经柱子。同时，柱子的下端连上塑胶管，弯成一个连通器，这个连通器的高度应该

16、略高于柱面，这样冲洗结束后，柱子就不会干。如果用这种方法，A就不用在实验室待一晚上了，因为一切都是自动完成的。 我现在跟A已经完全没有来往了, 但我对她映象还是十分深刻，主要就是因为她那晚跑柱子的经历。话撤远了，现在再回到蛋百质纯化课。（五）万金油buffer Dr. Burgess 这人特有意思，喜欢吹嘘他发现的小trick。比如，他得意说他是全美国最早用coomassie blue染蛋白胶的人。据他说，六几年的时候他看到一个澳洲的老兄的一片文章,讲述一种新奇的染料叫考马市亮蓝, 比当时流行的染料amido black灵敏十倍以上。所以他就写了一封信要了一些，结果效果奇好。我们听得都目瞪口呆。 不过Burgess最自豪的，还是他的“万金油”buffer。他告诉我们说，他几十年了，总喜欢用这个buffer的配方，什么蛋白都喜欢这种