松材线虫病检疫技术操作办法.docx

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松材线虫病检疫技术操作办法

松材线虫病检疫技术操作办法

　2009年08月07日　　点击数：

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中国森防信息网

松材线虫检疫技术操作办法

1 主题内容及应检范围

1.1 本办法规定了松材线虫Bursaphelenchus xylophilus（SteineretBuhrer）Nickle的检疫检验及检疫处理操作办法。

1.2 本办法适用于林业植物检疫机构对松科植物中松属Pinusspp.、冷杉属Abiesspp.、云杉属Piceaspp.、雪松属Cedruspp.s、落叶松属Larixspp.植物的树木、枝条、伐桩、木材（含原木、锯材、切片）及其制品（含包装材料、电缆盘等）的检疫检验和检疫处理。

2 产地检疫

2.1 踏查

2.1.1 在由松科植物构成的，或以松树为主的生态林、用材林，特别是有松树栽植的风景名胜地，疫情发生区及毗邻地区，曾调入染疫木材（含原木、锯材、切片）及其制品的城镇、工矿企业、交通干线附近、无线通讯台站、广播电视信号台站、电力线路、仓库、码头、车站、驻军营房、贮木场及加工场（点）、集贸市场，以自然界线、道路为单位进行线路（目测）调查。

2.1.2 调查松树的针叶是否有黄绿色、黄褐色、红褐色萎蔫，是否整株枯死或未全部变红仍有部分呈绿色；枯死树针叶在小枝上当年不脱落（如黑松、马尾松等）或脱落（如思茅松）；树脂分泌急剧减少，甚至停止；材质干枯，有蓝变现象。

2.1.3 调查松树是否有天牛危害的羽化孔、侵入孔、蛀道等痕迹。

2.1.4 需进一步确定疫情的，应取样进行分离鉴定。

2.1.4.1 在树干的下部（胸高处）、中部和上部（主侧枝交界处），用斧子、柴刀、木锯或木钻（钻头直径1-1.5cm）在木质部采集样品。

2.1.4.2 取样时在取样部位剥净树皮和外围木质部，直接砍取100-200g木片；或剥净树皮和外围木质部，用手摇钻从木质部至髓心钻取100-200g木屑；或在取样部位分别截取圆盘。

样品标签须填写清楚（包括采集地点、寄主、时间、采集人），与样品一起放入塑料袋内，用橡皮筋扎紧，带回室内检验。

2.2 贮木场及加工场（点）、集贸市场调查

2.2.1 木材（含原木、锯材、切片）及其制品采取楞垛表面或分层方式设点抽样调查。

2.2.2 调查数量每批次按总量（m3、垛）的5%-10%抽取，疫情严重的应全部进行抽样调查。

2.3 疫情监测

2.3.1 定期普查

2.3.1.1 对辖区内由松科植物构成的，或以松树为主的生态林、用材林以及松木贮木场及加工场（点），或人为活动频繁的公路两旁松林，应进行定期普查。

2.3.1.2 每年3-5月和8-10月，应对上述地区的松林进行全面普查。

2.3.2 人工监测

2.3.2.1 在疫情发生区及毗邻地区，在当年秋季刚刚枯死的病树树干下部（胸高处）、中部和上部（主侧枝交界处），剥净树皮，选取靠近蛀道、蛹室部位，用手摇钻钻至树心，取松木木屑（100-200g）进行分离鉴定。

2.3.2.2 对已确定发现松材线虫的林分，应对周围松林进行全面调查，以确定疫情发生范围。

2.3.3 打孔流胶法监测

2.3.3.1 对于松材线虫发生区或其边缘的松树，若外观正常，针叶无明显变色可以用打孔流胶法做初步诊断，要确定是否感染了松材线虫还需进行取样分离诊断法进行确认。

2.3.3.2 使用锤子和打孔器或铳子（直径10-15mm）在松树主干上打一可见木质部的圆孔，位置和方向不限。

2.3.3.3 在春、夏、秋季，打孔后24h即可进行观察；在冬季，打孔后48-72h进行观察。

2.3.3.4 观察打孔后松树流脂情况，按下述标准确定流胶级别。

   一级流胶：

树脂从孔口流下，渗出量很多；

   二级流胶：

树脂从孔口流下，渗出量较多；

   三级流胶：

树脂沉积在孔口下缘；

   四级流胶：

树脂渗出到圆孔壁上，呈粒状；

   五级流胶：

孔壁上无树脂流出。

2.3.3.5 对于三至五级流胶的松树，按2.1.4进行取样分离鉴定。

2.3.4 天牛引诱剂监测

2.3.4.1 于松褐天牛羽化期，在通风良好便于观测的山顶或林道旁设置诱捕器。

诱捕器距地面高度不得低于1.5m，诱捕器间距50-100m。

2.3.4.2 羽化高峰期1d检查1次，其余时间每隔3-5d检查1次。

将诱捕到的松褐天牛活体进行分离鉴定。

3 调运检疫

3.1 抽样比例

3.1.1 木材（含原木、锯材）及其制品按货物总量的0.5%-10%抽样，但样本数最低不得少于5个。

3.1.2 树木、枝条、伐桩按货物总量的1%-5%抽样，但样本数最低不得少于5个。

3.2 抽样方法

3.2.1 木材（含原木、锯材）及其制品、枝条、伐桩，采取表层或分层方式设点抽样检查。

3.2.2 抽取有蓝变特征或有天牛危害症状的树木、枝条、木材（含原木、锯材）及其制品。

3.3 现场检验

3.3.1 检查木材（含原木、锯材）及其制品的截面是否有松脂痕迹、密度明显减轻、木质部有蓝变现象及有天牛危害的蛀道、蛹室。

3.3.2 检查枝条、伐桩及其制品是否有天牛蛀道、蛹室、补充营养取食痕迹。

3.3.3 对有蓝变、天牛蛀道、蛹室的样本，每个样本取2份样品带回室内做进一步鉴定。

取样品时注意选取靠近蛀道、蛹室的部位，所取样品不得带有树皮。

4 检疫检验

4.1 对产地检疫、调运检疫所取的样品（含诱集到的天牛成虫）经制备后，采用贝尔曼漏斗法或浅盘法进行分离、镜检。

具体方法见附录1。

4.2 根据以下特征，鉴定是否属伞滑刃属：

虫体通常细长，唇区高，缢缩明显。

口针有小的基部膨大。

排泄孔位置通常在中食道球后方。

阴门有时突出，后阴子宫囊长。

雌虫尾端钝圆或尖。

交合刺大而狭，基部通常有明显的喙。

雄虫尾部向腹面弯曲，尾端尖，有一短的尾端交合伞。

在尾部通常有2对乳突，1对在肛门前，1对在肛门后。

无导刺带（引带）。

分属检索表见附录2。

4.3 对照松材线虫形态特征，鉴定是否为松材线虫Bursaphelenchus xylophilus（SteineretBuhrer）Nickle。

松材线虫与近似种拟松材线虫B.mucronatus在形态上的主要区别见附录3。

5 除害处理

5.1 发现携带松材线虫的木材（含原木、锯材）及其制品、枝条、伐桩等，可采取切片处理、热处理、熏蒸处理、销毁处理。

5.2 将病木切成厚度不超过1cm的碎片后用作纤维板、纸浆等工业原料。

或将病死木用旋切机切成厚度为3mm以下薄片，经80℃烘房热烘6h，制成刨花板、胶合板。

5.3 熏蒸处理方法见附录4。

5.4 将病树去皮锯板后置于热处理房，加热至木材中心温度达到65℃以上并保持2-3h（或利用微波处理），取出检查松材线虫死亡率，若死亡率达不到100%，继续进行处理直至松材线虫全部死亡为止。

5.5 如不具备上述条件，就地烧毁。

                               附录1 线虫分离方法  

   分离线虫可采用贝尔曼漏斗法和浅盘法。

   贝尔曼漏斗法 将玻璃漏斗（直径为10-15cm）置漏斗架上，下面接一段（10cm左右）橡皮管，橡皮管上装一个止水夹。

将劈成“火柴杆”状大小的分离材料，取湿重10g，用两层纱布包好，放入漏斗中，然后放入清水，清水以浸没分离材料为度。

经过4-24h，由于趋水性和本身的重量，线虫离开植物组织，并在水中游动，最后沉降到漏斗底部的橡皮管中。

打开止水夹，取底部约5-15ml的水样，其中含有样本中大部分活动的线虫。

在解剖镜下检查，如果线虫的数量少，可以离心（1500r/min，2-3min）沉降后再检查。

   浅盘法：

浅盘分离装置主要由两只不锈钢浅盘组成，其中口径略小的一只底部为粗网筛，放在另一只浅盘上面。

将两层纱布打湿铺于筛盘上，把样品劈碎（或钻取的木屑）置于筛盘纱布上，慢慢注入清水，使水浸没样品。

分离结束后，移去筛盘，把大盘内的分离液集中于小烧杯内。

小烧杯内的线虫分离液可通过自然沉降或离心机（1500r/min，2-3min）浓缩至适宜的量，以便镜检。

   常规镜检：

分别将各标号盛有线虫分离液的培养皿置于解剖镜下观察，先确认有无线虫。

对有线虫的样品进行活体镜检，观察它的一般形态结构。

然后选择几条成熟、特征易观察的线虫，用针或吸管移至载玻片上的水滴中。

将此载玻片在酒精灯火焰上方往返几次（5-6s）或放置于已盛满高温热水、打开盖子的保温瓶口上，蒸30-60s至虫体死亡，加盖玻片后在显微镜下观察。

根据形态特征予以初步鉴别，以确定是否需作进一步的鉴定。

   快速镜检：

（1）用显微镜直接观察线虫浓缩分离液。

分离液经一定时间后，当漏斗下端和乳胶管内出现透明度降低甚至混浊现象、表明线虫的游离量较多时，即可用培养皿接取混浊状分离液3-5滴，直接置于解剖镜下观察；如有线虫，就将盛有分离液滴的培养皿，放置于已盛满高温热水、打开盖子的保温瓶口上，进行30-60s的热杀处理，擦干培养皿底部凝结的小水珠，直接放置于显微镜下（先用低倍物镜，找到目标线虫，再转换到高倍物镜）观察形态特征予以鉴别。

（2）用显微镜直接观察线虫分离液。

用培养皿盛放贝尔曼漏斗放出的线虫悬液适量，直接移放在光学显微镜下观察，用低倍镜调整焦距，找到线虫，一手移动培养皿，不断变换所观察线虫的位置，一手不断调整焦距。

在10倍的接物镜下松材线虫的基本形态鉴定特征如头部、中食道球、阴门、交合刺、尾形等都可以清晰地观察到。

发现分离液中存有松材线虫时，挑取线虫并制成临时玻片标本进一步观察。

   形态鉴定：

依据雌雄成虫的形态，主要是雌成虫的形态进行鉴定。

但分离到的线虫没有成虫或极少时，需进行培养，以获得大量雌雄成虫供鉴定。

   常见的松材线虫培养方法是利用真菌培养线虫。

   100ml烧瓶中加入约30g浸泡2-4d的玉米粒，棉塞封口；或按5:

1的比例将玉米粒与来自健康黑松或马尾松的木屑混合后装入100ml烧瓶中，棉塞封口。

经121℃，10.34×104Pa条件下灭菌40min，冷却后接种灰葡萄孢Botrytiscinerea或球壳孢Sphaeropsissapinea等线虫喜食真菌，待真菌长好后，接种松材线虫，并置于25℃下培养。

   松材线虫表面消毒：

松材线虫分离纯化后，为了避免受到污染，在培养之前，需对线虫体表进行消毒。

消毒方法和消毒液根据工作需要进行选择，一般松材线虫的表面消毒液为0.002%放线菌酮和0.1%硫酸链霉素的抗菌素混合液。

（1）供试样品松材线虫个体较多时，在离心管内进行消毒。

具体做法是：

通过离心浓缩线虫至离心管底部，用无菌滴管将底部线虫液约2ml移入另一支无菌离心管中。

加入2ml双倍浓度的消毒液，轻轻振荡混匀，处理5min后，在1500r/min下离心5min，吸去上清液。

按上述步骤重复消毒1次，用无菌水换洗2次。

最后用无菌滴管将线虫吸入真菌培养基上。

（2）供试样品松材线虫个体较少时，在载玻片上进行消毒。

具体做法是：

将载玻片在70%酒精中浸泡1min，经过火焰灭菌，冷却后置于双目解剖镜镜台上。

将消毒液或无菌水分开滴在载玻片表面的3个点上，每点1滴，其中2个点为消毒液。

挑线虫至消毒液中，约1min后再依次转入另一消毒液滴和无菌水中。

最后用无菌细头滴管将经过消毒的线虫转至真菌培养基上。

   样木保温保湿培养：

将发现幼虫的样品切成长约10cm，横截面长、宽各1cm的小木棍多根，使其一端浸在水中至1/3处，放入25℃保温保湿培养箱中培养线虫，2-3d后能够获得所需的成虫。

同样将样本适量喷水后，