原核表达 I.docx
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原核表达I
原核表达I
PartⅠ选择表达的目的基因
一、基因序列
1.得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:
① 利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
② 实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③ 利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2.注意事项：
①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为completeCDS和partialCDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，completeCDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partialCDS的读码是相应的AA
②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测
1、 原理：
蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、 选择原则：
（1）、亲水性：
大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：
大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：
许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N端及C端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：
（1）预测：
如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
在线网站预测（http:
//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/index.shtmland http:
//www.imtech.res.in/raghava/propred/algorithm.html）
（2）选定：
接近N、C端；选取在此区间内，（AntigenicIndex）Jameson-wolf抗原决定簇选正分高处；（Hydrophilicityplot）Kyte-Doolittle预测亲水性强的区域。
同时符合以上3点的区域较好（命名为多肽片断A）。
注：
如果设计的多肽是跨膜蛋白，请尽量回避选择蛋白的跨膜区，即头端信号肽所在的区域
（3）NCBI（BlastP）比对：
将多肽片断A放入blastp进行同源性比对。
如果制备某一动物种属的抗体，该区必须与该动物的氨基酸序列没有较高的同源性。
注：
这一步往往容易漏掉，所以学会应用生物信息学，可以减少走弯路！
！
！
（4）抗原合成：
①原核表达：
②化学合成：
需要做化学偶联增强多肽稳定性。
多肽的纯度越纯越好，一般>80%就完全可以了。
合成5-10mg就可以了。
PartⅡ选择表达系统
一、选择表达载体
1、选择表达载体的原则
（1）蛋白质大小：
决定在胞质中表达还是以包涵体的形式表达，是否加标签或以融合蛋白的形式表达。
（2）蛋白需求量：
根据实验方案确定蛋白需求量，选择合适的载体。
（3）蛋白质是否需要保留活性：
有活性的可溶性蛋白表达（胞质蛋白），无活性的不溶的蛋白（包涵体蛋白）
2、原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：
（1）选择标志的编码序列：
用于筛选重组子，有抗生素抗性基因、报告基因（GFP等）
（2）可控转录的启动子：
启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。
启动子的强弱是对表达量有决定影响的因素之一。
没有启动子，基因就不能转录。
由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动。
原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。
在转录起始点上游5～10bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow盒，又名TATA盒或－10区。
来源不同的启动子，Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。
在距转录起始位点上游35bp处，有一段由10bp组成的区域，称为-35区。
转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。
-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。
原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac（乳糖启动子）、Trp（色氨酸启动子）、Tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）、lPL（l噬菌体的左向启动子）、T7噬菌体启动子等。
（3）转录终止子：
在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3¢末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子（terminator）。
转录终止过程包括：
RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。
对RNA聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C富含区域又具有回文对称结构。
这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构，并且有与A/T富含区对应的一串U。
转录终止的机制较为复杂，并且结论尚不统一。
但在构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的rrB核糖体RNA的转录终止子。
（4）核糖体结合位点（SD序列）：
1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10bp处的由3～9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16SrRNA3¢末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。
它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。
另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后，才能产生一个完整的蛋白质。
（5）多克隆位点（MCS）：
选择的酶切位点在靶基因上没有相应的酶切序列，否则在构建重组子进行酶切时会把靶基因给切开。
在惠赠或交换的质粒中确定MCS的正确性，否则会造成错读密码子。
（6）复制子：
通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。
pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI（pUC）类的复制子（复制起始部位）的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。
通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。
如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元（？
）是否相容的问题。
（7）融合Tag：
基因融合是将两个或多个开放阅读框按一定顺序连接起来，并且正确读码。
在表达靶蛋白是加上融合标签的好处，（a保护靶蛋白免受原核宿主蛋白酶的降解；b提供亲和纯化的配基结合位点；c改善靶蛋白的溶解性，使其正确折叠；d与已知酶或抗原结构域连接，可以进行标记和分离；e与信号肽连接，可将融合蛋白分泌到特定细胞区域。
）
注：
选择融合蛋白表达载体时，融合标签与靶蛋白的连接处如果有酶切位点，且想除去标签，则载体的酶切序列在靶蛋白中不能出现。
二、选择表达宿主
首先要看靶基因中有没有细菌不常用的密码子——如果有，需要考虑换表达菌株。
每种菌株都有自己独特的设计，或者是蛋白酶缺陷，或者是重组酶缺陷，改造的目的都是为了让质粒在细菌中存在更稳定，表达的产物不易被降解。
不同的载体要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7RNA聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。
采用不同调控机制会使用不同的表达菌株，所以换菌株一定要仔细看过载体的调控方式再换。
以Novagen为例，如果使用BL21（DE3）表达不成功的话可以换Rosetta系列菌株，它能够由一种氯霉素抗性的、与pET相容的质粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA的tRNA。
所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。
有时不明原因的表达蛋白截短（比预期的分子量要小很多）也可能是由于稀有密码子造成的。
另外一种可能是不严谨的本底表达产物抑制。
1. 原核表达系统（大肠杆菌）
优点：
①遗传图谱明确②容易培养且费用低③对许多外源蛋白耐受能力强④能高水平表达这些蛋白
缺点：
①蛋白质不能进行翻译后修饰（在真核高尔基复合体中的糖基化修饰，特点位点的切割等产生具有活性的蛋白）②具有密码子的偏好（？
）
2. 真核表达系统
优点：
可以产生修饰的蛋白
缺点：
①真核表达系统复杂②费用高
注：
不同的表达宿主有相应的表达载体，二者应是最佳表达组合。
PartⅢ构建重组子
一、重组子的构建
1.设计引物：
a保证引物序列扩出的靶基因插入到表达载体MCS上，能够正确读码；b引物两端加入酶切位点；c遵循引物设计原则（一般性引物自动搜索可采用“PremierPrimer5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo6”软件）。
2. 扩增靶基因：
（1）通过PCR方法：
以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环
获得所需基因片段。
（2）通过RT-PCR方法：
用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行
PCR循环获得产物。
注：
但在PCR过程中，需要减少突变的发生，可采用高保真酶，尽量减少PCR循环次数，增加模板和引物的浓度。
尤其注意不要引入终止
密码子。
3. 限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因：
（1）载体双酶切后回收：
将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
（减少假阳性的重组质粒连接，去除切下的小片段多克隆位点）
（2）PCR产物双酶切后回收：
限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法。
一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因，克隆进T－载体，然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。
注：
双酶切后，进行回收纯化，可以提高阳性克隆的几率。
4.连接目的基因和载体
二、重组子的验证
1.将连接产物转化到相应的宿主菌（感受肽的制备，转化）
2.鉴定带有重组质粒克隆：
常用方法的有α-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、PCR以及杂交筛选。
如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落（甚至全部为重组子）。
3.筛选出含重组子的转化菌落，DNA序列测定。
（正确测序）
测序结果出来后，首先，看看载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号，读码是否正确，这是最有说服力的鉴定结果。
有时载体几经多个实验人员的周转，反复插入片断，或者是粘端相同的不同酶切片断之间的连接，会意外在启动子后面带入终止位点，特别是用到XbaI之类的酶要小心。
然后要对测序结果进行确定，确定插入的每个碱基都是正确的，没有意外终止的情况。
注：
长期保存的重组子在高浓度甘油（19％）中会导致质粒不稳定，即脱质粒。
可
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