土壤微生物综合实验报告.docx
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土壤微生物综合实验报告
广州大学
综合设计性实验报告
课程：
微生物实验
实验课题：
土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶
活力的测定
学院：
生命科学学院
姓名：
徐嘉宽
学号：
1414300030
班级：
生技142
小组成员：
一实验摘要
本次实验通过采用5点采样方法在校园中采取2处土壤样品，运用梯度稀释的方法分离培
养出不同生长形态的细菌，镜检后挑选几个菌落进行纯培养，用淀粉培养基鉴定其是否产
淀粉酶，通过单染色、芽孢染色、革兰氏染色确定菌株的形态及革兰氏阴阳性，再通过各
株菌株其中一株为蜡状芽孢杆菌。
2种生化试验鉴定菌株的特性，确定了我们所分离的．
二实验目的
1.掌握从土壤等复杂的微生物环境中分离纯化技术
2.掌握培养基的配置方法及常用的微生物培养方法
3.掌握常用的微生物形态学鉴定方法、生理生化鉴定方法
4.了解微生物的16SrRNA序列鉴定方法、免疫学鉴定方法
5.掌握淀粉酶活力测定的原理及方法
6.掌握菌种保藏技术
7.培养数据统计、分析能力
8.培养团队协作精神，增强沟通合作能力
9.与其他小组交流合作、数据共享，进行更深入的探讨
10.学会查找、收集、整理资料
三实验原理
芽孢杆菌（BaciUus）是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细
菌。
这类细菌多数为腐生菌,主要分布于土壤、植物体表面及水体中,由于它们
能够产生对热、紫外线、电磁辖射和某些化学药品有很强抗性的芽孢,因此能忍
受多种不良环境。
土壤中蕴含着丰富的微生物资源,芽孢杆菌是其中具有重要应用价值的微生
物类群。
有些菌种可以分泌多种酶,可应用于工业生产;有些菌种能产生对昆虫
毒性较强的蛋白,可生产微生物农药;有些菌种可作为多种分泌蛋白基因表达受
体,在基因工程领域中有较高的应用价值。
土壤具有微生物进行生长繁殖和生
命活动中所需的各种条件，是微生物生活最适宜的环境。
其中的微生物的数量
因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。
一般地说，在土壤表面，由
于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10cm～30cm的土
层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少。
淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称,是用于酿酒、食品、医药、纺织、饲
料等具有商业价值的重要酶类。
广州大学城四面环江，地处南亚热带,其气候属南亚热带典型的季风海洋气
候。
芽孢杆菌资源非常丰富。
本方案在广州大学城预定区域釆集土壤样品,采用
纯培养的方法,分离获得芽孢杆菌。
对菌株进行形态学观察及生理生化分析,以
挑选出可产淀粉酶的菌株。
．
四实验材料
1.试剂与配方
试剂：
牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、葡萄糖；可溶性淀粉、
K2HPO4、KNO3、MgSO4?
7H2O、FeSO4?
7H2O、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水等
工具:
取样：
铁锹、尺子、塑料袋等
培养：
接种环（针）、培养皿、试管、试管架、锥形瓶、塞子、标签纸、
打火机、酒精灯、报纸、橡皮筋、无菌棉签、载玻片、香柏油、二
甲苯、擦镜纸、精密pH试纸、吸水纸、培养基平板，无菌水，试管
架，酒精灯，酒精瓶，记号笔，废物缸，牙签等；
其他工具：
无菌操作台、恒温振荡培养箱、恒温培养箱
配方：
1）牛肉膏蛋白胨培养基：
营养琼脂3.3%、蒸馏水100mL、pH7.2-7.4。
2）营养肉汤:
牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、NaCl0.5%、蒸馏水100ml、pH（5.7、7.2→对
照）。
3）半固体培养基（运动性试验）:
琼脂0.5%、牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、NaCl0.5%、蒸馏水
100ml、pH7.2-7.4。
4）酪素水解培养基（酪素水解试验）:
取5g脱脂奶粉与一号三角瓶中，加入50ml蒸馏水，110℃灭菌。
另称1.5g
琼脂置于含50mL蒸馏水的二号三角瓶中,120℃灭菌,待冷至45-50°C时,
将两液混匀倒成平板,即为牛奶平板。
将平板倒置过夜,使表面水分干燥。
5）淀粉水解培养基:
营养琼脂3.3%、可溶性淀粉2%、蒸馏水100ml、PH7.2-7.4
6）卵黄反应培养基：
无菌条件下去卵黄加等量的生理盐水，摇匀后，取5ml加入到融化的约
50-55℃的100ml的营养琼脂中（内含1g葡萄糖），混匀后倒入培养皿内。
制成的卵黄平板过夜后即可使用。
7）硝酸盐还原实验培养基:
胰蛋白胨1.0%,酵母浸粉0.5%,NaCl1.0%,KN030.1%,蒸馏水1OOmL,调节
pH7.0。
8）发酵培养基:
玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、CaCl20.02%、MgSO40.02%、NaCl
0.25%、K2HPO40.2%、柠檬酸钠0.2%、硫酸氨0.075%（溶解后加）、
Na2HPO40.2%,pH值7.0。
9）明胶培养基：
NaCl0.5%、蛋白胨1.0%、牛肉膏0.3%、明胶12%、蒸馏100mL，调pH
。
7.2-7.4．
10）西蒙斯氏柠檬酸钠盐培养液：
柠檬酸钠0.2%、NaCl0.5%、MgSO40.02%、磷酸二氢钾0.1%、磷酸氢氨0.1%、
溴麝香草酚蓝水溶液1ml、琼脂2%、蒸馏水100ml、PH7.2-7.4。
11）耐盐试验培养基（2%、5%、7%、10%）：
营养琼脂3.3%、NaCl（0.2%、0.5%、0.7%、1.0%）、蒸馏水100ml、PH7.2-
7.4。
12）糖发酵培养基（110℃灭菌）
12-1葡萄糖发酵培养基：
葡萄糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子
0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。
12-2乳糖发酵培养基：
乳糖1.5%、蛋白胨0.2%、NaCl0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子
0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。
12-3木糖发酵培养基：
木糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子
0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。
12-4阿拉伯糖培养基：
阿拉伯糖1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分
子0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。
12-5甘露醇发酵培养基：
甘露醇1.0%、蛋白胨0.2%、NaCl0.5%、磷酸氢二钾0.02%、溴钾分子
0.2%（最后加入）、PH7.2-7.4。
13）葡萄糖蛋白胨培养基（VP、MR试验）（110℃灭菌）：
葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、NaCl0.5%、PH7.2-7.4。
14）蛋白胨水培养基（吲哚试验）：
蛋白胨1.0%、NaCl0.5%、PH7.2-7.4。
15）酪氨酸培养基（酪氨酸水解试验）：
L-酪氨酸0.5g悬浮于10ml蒸馏水中，20min110℃灭菌，与100ml无菌营
养琼脂混合，即成酪氨酸水解平板。
16）1%麦芽糖溶液
取0.1g麦芽糖,加入蒸馏水定容至100ml。
17）0.85%无菌生理盐水
称取0.85gNaCl于100ml蒸馏水中，摇匀，120℃灭菌。
18）1%3,5-二硝基水杨酸试剂
称取1g3,5-二硝基水杨酸,溶于20ml浓度2mol/L氢氧化钠溶液中,加
入50ml蒸馏水,再加入30g四水酒石酸钾钠（C4H4KNaO6·4H2O）,待溶解
后用蒸馏水定容至100ml,盖紧瓶塞,勿使CO2进入。
19）2%淀粉溶液:
称取2g可溶性淀粉溶于100ml浓度0.1mol/mlpH值5.6柠檬酸缓冲液
中。
20）生化鉴定：
草酸铵结晶紫染色液、路哥氏碘液、95%乙醇、0.5%番红染液、香柏油、
萘酚溶液、甲基红试剂等-5%α、40%KOH二甲苯、乙醚、碘液、吲哚试剂、．
五实验步骤
1.土壤取样
分别在网球场旁的草地和体育馆后面的草地采集5-20㎝深度的土壤，五点
采样，依次编号“1、2、3…”样品装在无菌纸袋中。
分别标记为样品一和样品
二。
记录采样时间、地点、环境、土壤类型、pH等。
样品4℃保存备用。
2.分离纯化
称取5g土样加入45mL无菌生理盐水中,混勻，80°C水浴30min,以杀死
无芽孢细菌。
10倍梯度稀释10-2-10-5倍。
用一支新的无菌枪头从各浓度土壤稀释液中分别吸取0.2mL涂布于已标记
好稀释度的牛肉膏蛋白胨培养基上,每个浓度梯梯度取两个重复,标记日期、时
间、组别，置于37℃培养箱中培养24h。
观察已培养的细菌，将形态不同的菌落在皿底用记号笔编号
“A01、A02、A03…”后，进行划线纯化。
先在已经平板培养基的一边作第1次
平行划线3~4条，再转动培养皿约60°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却
后通过第1次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2平行划线部分作
第3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线。
划线完毕，在
培养皿底部和顶部写上菌落编号和对应的纯化次数“A01-1、A02-1、A03-1…”。
标记日期、时间、组别后，将培养皿倒置于28~29℃恒温培养箱中培养约
20h。
再继续分区划线2次，以获得较纯的菌种。
每次划线完毕，在培养皿底部
和顶部写上菌落编号和对应的划线次数，标记日期、时间、组别。
注意观察记
录菌落形态、表面及边缘特征等，为“4.3、初步鉴定”提供基础。
纯化三、四次后镜检，挑取纯化的菌种进行单染色，观察细菌是否为杆状，
以及细菌的大小、两端形态、粗细、着色深浅等是否一致。
若不全为杆状，则
弃用，若个体形态不一致，且形态不一致的两种或多种细菌数量相当，则再次
纯化，直至个体形态一致。
3.产淀粉酶芽孢杆菌的筛选
用接种沾取纯化的菌落分别点种到含淀粉培养基的无菌平板上，并标记菌
落编号、日期、时间、组别，放置在37℃恒温培养箱中培养48h。
取出平板滴
加路哥氏碘液，缓慢摇晃至碘液将平板覆盖均匀，静置，产生透明圈的菌株初
步定为淀粉酶产生菌株!
同时，测定产生透明圈的宽度，选择比较大的且菌落形
态不同的两株菌株进行芽孢染色和革兰氏染色。
从试管中沾取备份菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃培养12h进行革
兰氏染色，培养24h进行芽孢染色。
若未观察到芽孢，挑取与之前挑取位置不
同位置的菌落再次染色观察。
若仍未观察到芽孢，从试管中挑取形态与选取的．
菌株不同的菌株进行活化、染色。
4.单染色方法：
1、涂片：
用1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸馏水，再用无
菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充分混匀涂成薄膜。
2、干燥：
将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。
3、固定：
涂面朝上，通过微火2-3次。
4、染色：
待玻片冷却后加结晶紫（或者石炭酸复红）1-2滴于涂片上，覆
盖涂面染色1-2分钟。
5、水洗：
倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止
（注：
勿冲去菌体）。
6、干燥：
自然干燥，或用吸水纸吸干。
7、镜检：
油镜观察并绘图。
将纯化得到的单菌落分为两份，其中一部分接种于试管斜面培养基37℃培
养24h后，于4℃保存备用，每个菌株做两个重复备份，将菌株的原有编号中
的A替换为B，添加重复序号后编号，如“B01-3-1、B01-3-2、B02-3-1”；另
一部分用来做产淀粉酶的芽孢杆菌筛选。
5.芽孢染色方法：
1、涂片、干燥及固定
2、加温染色：
加5%孔雀绿染色液于玻片上，微火加热至冒蒸汽维持5分
钟。
3、水洗将玻片冷却，水洗直到流出的水中无绿色为止。
4、常温复染：
加番红染色2分钟后，倾去染色液，水洗，直接用吸水纸吸
去余水。
5、镜检：
用油镜观察。
记录结果。
6.革兰氏染色方法：
1.涂片、干燥及固定
2.初染：
在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1-2分钟，倾去染液，
流水冲洗至无紫色。
3.媒染：
先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后
水洗。
4.脱色：
除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约25秒，后立即用流水冲
洗。
5.复染：
滴加番红染色液，染2分钟，水洗后用吸水纸吸干。
6.镜检：
观察记录染色结果。
再次测定产淀粉酶性能7.
用接种沾取已初步鉴定的菌株分别点种到含淀粉培养基的无菌平板上，并．
标记菌落编号、日期、时间、组别，放置在37℃恒温培养箱中培养48h。
取出
平板滴加路哥氏碘液，缓慢摇晃至碘液将平板覆盖均匀，静置，产生透明圈的
菌株初步定为淀粉酶产生菌株!
同时，测定产生透明圈的宽度，选择比较大的且
菌落。
7.菌种的长期保存
从试管中取产淀粉酶性能较优的若干菌株用以下方法长期保存。
改进的甘油菌种保存法：
取上述典型菌落接种肉汤管,37℃恒温振荡培养箱
培养4～6h（亦可置于普通温箱培养6～8h）然后按5份培养液加入2份保存
液的比例加入已灭菌的保存液,分装于灭菌的微量离心管或细胞冻存管中,标记
每株细菌保存2支,置-20℃冰箱保存。
8.初步鉴定
前面的实验挑选出了可产淀粉酶的芽孢杆菌，分离出阴性菌和阳性菌并分别培养。
9.生理生化鉴定
（1）接触酶试验：
用接种环挑取适量菌苔插入装有H2O2的试管中，观察是否有大量气泡产
生，将接种环灼烧、冷却后插入H2O2中作空白对照。
（2）糖发酵试验：
用接种环将两种杆菌分别接种于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇的发酵
管内，每种发酵管做两个平行，标记，并设置不接种菌的相同发酵管做空
白对照37℃培养24h。
观察记录，与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴
性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“-”表示，若培养液呈黄色，反
应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“+”表示。
培养液
的杜氏小管内气泡明显增大为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸产气，记
录用“+”表示，如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“-”表示。
（3）V.P试验：
取葡萄糖蛋白胨培养液的试管，编号，以无菌操作分别接种少量菌苔至以
上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24h，培养完
后，取出上述试管充分震荡2min每管分别加入40%NaOH溶液10~20滴，
并加ɑ—萘酚，振荡试管，置37℃温箱中保温15-30min后，若培养基呈
红色，记录为V.P试验阳性反应（+）表示，若不呈红色，记录为V.P试
验阴性反应（用“-”）表示。
（4）MR试验：
取葡萄糖蛋白胨培养液的试管，编号，以无菌操作分别接种少量菌苔至以
上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24h，培养完
后，取出上述试管，加入甲基红试剂2滴，变红色则呈阳性（+），黄色为
阴性（-）。
）吲哚试验：
5（．
取装有蛋白胨水培养液的试管编号，以无菌操作分别接种少量菌苔到以
上相应试管中，并做空白对照，置37℃培养箱中24h，在培养液中加入
乙醚1-2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于
培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，
乙醚层呈玫瑰红色，说明吲哚试验为阳性反应，否则为阴性反应。
（6）耐盐试验：
将分离获得的菌种分别接种在含盐2%、5%、7%、10%的培养基中，设置
一组对照，一组平行实验组，并置于37℃下培养，观察生长状况，并做
记录。
记录方式如下：
不生长：
-，生长差：
+，生长一般：
++，生长良
好：
+++；
（7）柠檬酸盐利用试验:
取若干装有西蒙斯柠檬酸盐培养基的试管，将菌种接入试管，置于37℃
恒温箱中培养24~48h。
若培养基为蓝色，则表明能利用柠檬酸盐作为碳
源生长，以“+”表示。
若培养基为绿色则为阴性，以“—”表示。
（8）明胶试验:
挑取菌种，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养
基。
于20~22℃培养7~14天。
每天观察结果，若因培养温度高而使明胶
本身液化时，应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细
菌液化，如确被液化，即为试验阳性，以“+”表示。
平板试验结果的观
察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，10-20min后，菌
落周围应出现清晰带环。
否则为阴性。
（9）硝酸盐还原试验:
接种于硝酸盐培养基中，于35℃培养1-4d.将甲、乙液等量混合后（约
0.1mL）加入培养基内，立即观察结果。
结果：
出现红色为阳性。
若加
入试剂后无颜色反应，可能是：
①硝酸盐没有被还原，试验阴性；②硝酸
盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少
许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。
若仍不产生红色，表示试验
为假阴性。
若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一杜氏小管，
如有气泡产生，表示有氮气生成。
（10）酪素水解试验：
取牛奶平板，将菌种划线接在平板上，每皿1株菌。
设置一组对照，一组
平行实验组，并置于37℃恒温箱培养，若菌落周围和下面酪素已被分解
而呈透明则为阳性。
（11）酪氨酸水解试验：
取酪氨酸平板，将测试菌接种于划线接于培养基上，设置一组对照，一组
平行实验组，并置于37℃恒温箱培养，若酪氨酸结晶被水解而变透明则
为阳性。
（12）运动性试验：
使用半固体营养琼脂试管,将接种针从培养基中央自上而下直刺到试管底
1-1.5cm处，沿穿刺线拔出接种针，置于37℃培养箱中培养24小时观察。
观察是否为树根状生长，若有，则菌株有鞭毛，若直立生长，则菌株无鞭
毛。
．
（13）温度试验：
使用牛肉膏蛋白胨培养基，将菌株接种到平板上，分别在5℃、15℃、
20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃条件下培养24
小时，观察细菌是否生长。
（14）PH试验：
将菌株分别接种到不同PH为5.7和7.2的营养肉汤中，置于37℃培养24
小时，观察是否长菌，比较生长情况。
（15）卵黄反应试验：
取18-24小时的斜面或培养液中的菌体，点种在卵黄反应培养基中，点的
直径约为2-3mm，置于37℃培养箱中培养18-24小时，观察，如菌落四周
形成乳白色的浑浊环，表示卵磷脂分解生成脂肪，说明有卵磷脂酶。
（16）0.001%溶菌酶试验：
将菌种制成菌悬液，涂布在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，将干净的小滤纸
片充分浸在溶菌酶试剂中，贴在平板上，置于37℃培养箱中培养24小时
后观察，若出现抑菌圈，则为阳性反应，无则为为阴性反应。
结果鉴定10.
查阅伯杰氏手册，判断分离的菌种。
.根据以上测定结果，
六注意事项
1、称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。
调pH时要小心操作，避免回
调。
不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。
2、革兰氏染色时注意脱色的时间的控制，过长或过短都会影响实验结果。
3、现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。
你应如
何确保你的染色结果的正确性。
4、进行染色鉴定时，都应有已知的对照菌种在同等条件下染色，然后进行对比记录结果。
5、在芽孢染色中，应注意温度的控制，避免染料在玻片上蒸腾，否则影响实验结果。
6、配制柠檬酸盐培养基时要控制好pH，不要过碱，配出的培养基以浅绿色为准。
7、在测验MR试验的结果时，甲基红指示剂不可加太多，以免出现假阳性反应。
8、实验中用到的试管、培养皿等仪器要贴明标签，在接种或者使用时必须仔细核对菌名和
培养基，以免弄错。
9、配制吲哚试验用的蛋白胨水培养基，宜选用色氨酸含量高的蛋白胨（用胰蛋白酶水解酪
素得到的蛋白胨，色氨酸含量较高），否则将影响产吲哚的阳性率。
10、菌株较多，务必注意标记的准确性。
11、务必保证原始记录准确、详细。
、全程拍照记录，务必准确记录照片信息，避免出现“有照片，却忘记照片记录的是什12．
么内容”这种尴尬。
13、注意记录菌株所对应的土壤样品编号。
14、若芽孢杆菌菌龄较小，可能会出现革兰氏阴性反应。
15、为保证最后获得的菌株是从土壤中分离出来的，从取样开始就要注意无菌操作。
七实验结果与分析
1.土壤样品
土壤序号
采集地采集时间点
天气温度
土壤颜色
土壤气味
土壤湿度
1
广大体2015-12-2育场后10:
34a.m.草地
27℃
偏红褐色
土腥味
干燥
2
广大网2015-12-球场附2210:
52a.m近.
27℃
黄色
土腥味
干燥
2.稀释涂布生长情况
土壤序号稀释梯度
10-2
10-3
（1）
10-3
（2）
10-4
1
多菌落，有5种不同的菌
有一片白色致密的菌苔，一个黄色光滑的菌落还有4个连在一起的白色半透明菌落
一大片白色光滑菌落
一个白色光滑的菌落
2
较多菌落，
一个放射状绒毛白色菌落和一个较小白色菌落
无菌
两个白色光滑菌落
经过讨论，我们选取了两个10-3梯度进行稀释。
经过24h后，我们挑取生长出的各菌进行培养，划线分离2次后，进行镜检。
3.镜检
a.单染色观察：
菌种A：
用显微镜在10*100的放大倍数下进行观察，可以观察到红色的链状排列的杆菌，同时还有其他不同粗细的
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