广州市市售黄瓜上细菌质粒介导的喹诺酮耐药基因检测分析及未来研究展望.docx

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广州市市售黄瓜上细菌质粒介导的喹诺酮耐药基因检测分析及未来研究展望

摘要

近年来,由于抗生素的滥用直接诱导动物体内及环境中菌群产生抗生素抗性基因（antibioticresistancegenes,ARGs）,从而加速了抗性基因在环境与肠道菌群间的传播扩散。

而氟喹诺酮类药物（Fluoroqulnolones,FQs）是近代化学合成抗感染药物中发展最为迅速的药物,具有抗菌谱广、抗菌活性强、体内分布广等优点,因此成为了人和动物临床应用最为广泛的药物之一。

近年来一系列质粒介导的喹诺酮耐药（plasmidmediatedquinoloneresistance,PMQR）基因的发现引起了人们对PMQR基因在细菌间水平传播的高度重视。

本文针对2013年9至10月间在广州市25个菜市场，农贸市场，超市等的113个摊位购买的113份黄瓜样品，用营养肉汤对采集到的113份样品进行了增菌，并用PCR的方法对增得的细菌进行了PMQR基因的检测,其中qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA、oqxB、aac（6’）-Ib的检出率分别为8.85%、26.55%、0.88%、0.88%、61.95%、10.62%、62.83%、91.15%、21.24%；同时我们设想了对两种低流行的耐药基因（qnrC、qnrD）在样品中的快速检测及研究的方式，即先用营养肉汤增菌，再对阳性样品（qnrC、qnrD基因检测阳性）进行细菌分离鉴定，并对未来的研究提出了展望。

结论：

市场上销售的以黄瓜为代表的即食蔬果表面细菌PMQR基因流行严重，且一般的清洗不能完全将其除去；我们建立的这种方式能够较简便地筛选到某一样品中低流行的耐药基因，并对其中能在营养肉汤中生长的细菌进行快速分离，有助于发现新的耐药基因亚型，也有助于推测一份样品中不同菌属之间是否存在质粒交换。

关键词：

PMQR基因水平传播细菌危害.

HighPrevalenceofplasmidmediatedquinoloneresistanceGenesinBacteriaonCucumbersinGuangZhouMarketsandtheDesignintheFollowingStudy

YaoXiangyang

（Collegeofveterinarymedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China）

Abstract：

Broad-spectrumfluoroquinoloneantibioticsarecentralinmodernhealthcareandareusedtotreatandpreventawiderangeofbacterialinfections.Thediscoveringofaseriesofplasmidmediatedquinoloneresistancegeneshasdrewpeople’attentiontotheqnrgeneshorizontaltransmissionamongpathogensandenvironmentalbacteria.Asformanyantibioticresistancegenespresentinpathogenstoday,qnrgenesarehypothesizedtooriginatefromenvironmentalbacteria.

ToinvestigatetheprevalenceofPMQR（plasmidmediatedquinoloneresistance）genesinready-to-eatfreshvegetables,analysisitspossibilethreattohumanhealth,andthengivesomeadvicetopeoplewhoareoftenhavingready-to-eatfreshvegetables.113cucumbers’sampleswerecollectedfromGuangZhoumarketsduring2monthsoftheautumnseasonin2013.Theprevalenceof9PMQRgenesweredetectedbyPCRfromculturablebacteriawhichwerecultivatedfromthesesamples.ThepercentageofqnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA、oqxB、aac（6’）-Ibwere8.85%、26.55%、0.88%、0.88%、61.95%、10.62%、62.83%、91.15%、and21.24%.Surprisingly，91.15%samplescontainedatleastonePMQRgene.

ThestatisticaldateobviouslydrawaconclusionthatPMQRgeneswerewidelyexistedintheculturablebacteriaofcucumbersinGuangZhoumarkets,eventheusualcleaninganddisinfectioncouldnoteliminatetheperniciousinfluence.Itmayenterintoourbodybyeatingandhorizontaltransmittootherbacterialivingintheintestinaltract,addingtheriskofantibioticresistancegenes’emerginginpathogens,whichmaycausegreatharmtohealth.Therefore,itisnotgoodforpeople’shealthtoeatfreshvegetablesdirectly.It’sbettertocookthemorremovethepeelbeforeeating,andtryourbesttoeliminateorreducetheperniciousinfluence.

Keywords：

PMQRgenesready-to-eatfreshvegetablesperniciousinfluence

1前言5

1.1氟喹诺酮类药物..................................................................................................................5

1.2质粒介导的哇诺酮类耐药基因..........................................................................................5

2材料与方法6

2.1材料6

2.1.1培养基6

2.1.2酶和主要试剂6

2.1.3主要仪器和设备7

2.1.4溶液配制7

2.2方法7

2.2.1样品的采集7

2.2.2样品的处理及细菌的培养7

2.2.3细菌的处理及模板的制备8

2.2.4PMQR基因的检测8

2.2.4.1引物的设计合成及退火温度等8

2.2.4.2PCR反应体系及程序...................................................................................................9

2.2.4.3扩增程序..........................................................................................................................9

3结果10

3.1以oqxB基因为代表的PCR凝胶电泳图谱10

3.2统计分析11

3.3对市售黄瓜上细菌PMQR基因的检测初试的思考及思考后展望12

3.3.1细菌的复活及有关菌株的分离培养........................................................................................12

3.3.216SrRNA鉴定................................................................................................................13

3.3.3PCR产物的回收纯化与鉴定........................................................................................13

3.3.4PCR纯化产物与载体连接............................................................................................13

3.3.5DH5α感受态细胞的制备...............................................................................................14

3.3.6连接产物转化DH5α感受态细胞..................................................................................14

3.3.7可疑菌落的筛选.............................................................................................................14

4讨论15

5结论及进一步讨论...................................................................................................................................16

5.1.结论...........................................................................................................................................................16

5.2进一步讨论............................................................................................................................................17

参考文献18

致谢22

1前言：

1.1氟喹诺酮类药物：

喹诺酮类药物是一类化学合成类抗菌药物，其基本结构是1，4-二氢-4-氧-3-喹啉羧酸。

第一代喹诺酮类药物是（LESHERGYetal,1962）在1962年发现的，由于其对厌氧菌无活性和革兰氏阳性菌无作用，加之其抗菌谱窄，药代动力学和安全性不理想，现已被取代。

随后逐步对第一代喹诺酮类药物结构进行修饰，得到第二代喹诺酮类药物，其主要用于治疗肠道的感染。

直到1978年，日本杏林公司（张长利等，1990）在C-6引入F原子后得到第三代氟喹诺酮类药物，其杀菌作用强且生物利用度高等特性使其得到广泛地应用。

第四代氟喹诺酮类药物与前三代抗菌药相比其抗菌能力进一步增强，尤其对革兰氏阳性菌（张继瑜等）。

氟喹诺酮类药物因其广谱杀菌活性和良好的药动学等特点，在临床治疗感染性疾病中得到广泛的应用。

然而，持续广泛的应用甚至滥用氟喹诺酮类药物的现象，造成很多耐药菌株的出现及其耐药水平的提高。

1.2质粒介导的哇诺酮类耐药基因

过去普遍认为细菌对哇诺酮类的耐药机制主要是染色体基因突变（靶位改变、主动外排和膜孔蛋白缺失）,而不存在水平传播的可转移基因。

1998年，（Martineetal,1998）在一株肺炎克雷伯菌首度发现由质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrA。

随后qnrS（Jacobyetal,2006）、qnrB（Hataetal,2005）相继被发现。

近些年来越来越多的国家与地区对qnr流行情况进行了报道（Wangetal,2003;Mammerietal,2005），证实了这一机制在耐药性形成中所起的作用。

qnr基因虽具有多个分型，但其本身仅介导低水平的耐药。

2006年，Robicsek等（Robicseketal,2006）报道了一种新的质粒介导的耐药基aac（6'）-Ib-cr。

与aac（6'）-Ib不同的是，aac（6'）-Ib-cr可水解环丙沙星和诺氟沙星哌嗪环上的N，破坏药物的抗菌能力。

日本学者Kunikazu等，2007年首次报道了质粒介导的喹诺酮类主动外排泵基因qepA（Yamaneetal,2007）。

整合子为自然界存在的具有捕获、整合以及表达基因盒能力的基因表达系统。

整合子元件能介导耐药基因在不同菌群间有效的传播（Recchietal,1995）。

目前已发现与耐药性有关的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类整合子（Halletal,1999）。

其中最常见的是Ⅰ类整合子，它可以通过首尾相接的方式整合一个或多个耐药基因盒（Halletal,2003），研究证明aac（6'）-Ib-cr基因常与qnr基因一起存在于Ⅰ类整合子上，从而导致了细菌对喹诺酮类等药物的多重耐药（Warrenetal,2008;Wangetal,2004）。

外排机制最近也在质粒中发现,该类机制主要包括QepA和OqxAB两类外排泵,而其中的OqxAB在2009年才被归为pMQR家族（杨铜等）。

动物养殖业中抗生素的不合理使用会导致动物体内的细菌普遍产生耐药性。

这些耐药菌携带的耐药基因连同未被完全吸收的抗生素,会随着动物的排泄作用进入养殖废水,经过废水的灌溉作用以及雨水冲刷、地表径流和大气扩散等多种途径进入养殖场周边甚至更远的环境介质中。

耐药基因一旦进入环境,它们就会借助细菌可移动遗传元件,在不同介质中的微生物菌群之间进行水平转移。

而残留抗生素很可能会促使它们在环境中增殖、迁移并向更广阔的环境领域中扩散。

甚至,这些耐药基因还会通过食物链进入人体,给人类健康带来潜在的危害（李娟等）。

为了解即食蔬果上所携带的PMQR基因的情况，我们选择了黄瓜这种最为常见的凉拌蔬菜，于2013年9至10月间在广州市25个菜市场，农贸市场，超市等的113个摊位购买的113根黄瓜，分离到113株细菌，并对所培养的细菌用PCR方法对质粒介导的喹诺酮耐药（plasmidmediatedquinoloneresistance,PMQR）基因进行了检测，以评估这种环境污染物的流行情况，为以后其他即食蔬果上PMQR基因流行情况的研究提供数据。

与此同时，我们还设想了一种对低流行的耐药基因在肠杆菌科中的快速检测及研究的方式，即先增菌，再对阳性样品进行细菌分离，这种方式能够较简便地筛选到某一样品中低流行的耐药基因，并对其中可分离的细菌进行快速分离，有助于发现新的耐药基因亚型，也有助于推测一份样品中不同菌属之间是否存在质粒交换。

2材料和方法（materialandmethods）:

2.1材料

2.1.1培养基

营养肉汤（营养broth）,麦康凯琼脂（MacConkeyAgar），伊红美兰琼脂（EMB

Agar），LB琼脂（LBAgar），LB肉汤（LBBroth），水解酪蛋白琼脂（MHAgar），水解酪蛋白肉汤（MHBroth）等，购自青岛海博生物技术有限公司（固体或液体培养基均为高压灭菌后使用）。

2.1.2酶和主要试剂

TaKaRaTaqTM（5U/μL）、NTPMixture（2.5mM）、10×rTaqBuffer（Mg2+Plus）、DL2000（50ng/μL）、λ-HindIIIdigest（50ng/μL）、LysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR试剂、TaKaRaTaq™Version2.0购自宝生物工程（大连）有限公司，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司深圳分公司合成。

琼脂糖（Biowestagarose，regular），购自西班牙Biowest公司。

其他试剂：

EDTA、乙酸甲、丙三醇、异丙醇、无水乙醇、磷酸二氢钠、氯化钠、氢氧化钠、浓盐酸、冰醋酸、等购自广州化学试剂厂。

2.1.3主要仪器和设备

THZ-C恒温震荡箱：

广州神华生物技术有限公司；

恒温培养箱：

型号GZX-9023BOXUN苏州江东精密仪器有限公司。

电子分析天平：

0.00001，Sartorius/赛多利斯

微量移液器：

德国Eppendorf公司；

超净工作台：

苏州净化设备有限公司；

HHVE-50高压灭菌锅：

日本HIRAYMA公司；

台式高速离心机：

德国Eppendorf公司；

热循环梯度PCR仪（BIOMETRAPCR仪）：

Tpersonal德国BIOMETRA；

电泳凝胶成像系统：

美国Bio-Rad公司；

DYCP-31C型电泳槽：

北京六一仪器厂；

MilliQ生理盐水仪：

美国Millipore公司；

2.1.4溶液配制

（1）生理盐水：

1000ml生理盐水加入8.50gNaCl，高压灭菌后常温保存。

（2）50×TAE（1000mL）储备液配制

Tris242g

冰乙酸13.75mL

0.5mol的EDTA100mL（pH8.0）

（3）LB液体培养基：

蛋白胨（tryptone）（OXOLD公司）10g、酵母提取物（yeast

extract）（OXOLD公司）5g、NaCl10g，加800mL双蒸水，用5mol/LNaOH

调pH至7.4，定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。

2.2方法（materialandmethods）:

2.2.1样品的采集:

2013/8/26至2013/9/6在广州的25个菜市场，农贸市场，超市等的113个摊位购买了113份黄瓜样品。

2.2.2样品的处理及细菌的培养:

买回的黄瓜先经过洗洁精清洗，再无菌水冲洗两遍,，最后在超净台中自然风干5min后，用75%的酒精擦拭后，用无菌手术刀刀片在擦拭过的部位取一小块黄瓜外皮组织块，经营养肉汤200rmp震荡培养24h。

2.2.3细菌的处理及模板的制备：

取菌液两毫升于2ml的EP管中，10000g离心1min，倒掉上清，加入200ul无菌生理盐水悬浮，10000g离心1min，200ul无菌生理盐水再悬浮一次，10000转离心1min后，尽可能倒掉上清，用无菌枪头吸取1ul沉淀菌体加入50ulLysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR中，80°C水浴15分钟后4°C保存作为模板，并于7天内用完，另取2ml所增菌液30%无菌甘油保存于--80°C。

2.2.4PMQR基因的检测

表1引物的设计合成及退火温度等：

Targetgene

Primersequence（5’-3’）

Amplicon

size（bp）

Annealing

temperature

qnrA

AGAGGATTTCTCACGCCAGG

580

（Cattoiretal.2007a）

TGCCAGGCACAGATCTTGAC

qnrB

GGMATHGAAATTCGCCACTG

264

（Cattoiretal.2007b）

TTTGCYGYYCGCCAGTCGAA

qnrC

GGGTTGTACATTTATTGAATCG

307

（BinKimetal.2009）

CACCTACCCATTTATTTTCA

qnrD

TTTTCGCTAACTAACTCGC

996

Thisstudy

GAAAGGATAAACAGGCAAAT

qnrS

GCAAGTTCATTGAACAGGGT

428

（Cattoiretal.2007a）

TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG

qepA

CCAGCTCGGCAACTTGATAC

570

（Xiaetal.2010）

ATGCTCGCCTTCCAGAAAA

oqxA

CTCGGCGCGATGATGCT

392

（Kimetal.2009）

CCACTCTTCACGGGAGACGA

oqxB

TCCTGATCTCCATTAACGCCCA

131

（Kimetal.2009）

ACCGGAACCCATCTCGATGC

aac（6’）-Ib

TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA

482

（Parketal.2006）

CTCGAATGCCTGGCGTGTTT

16SrRNA

799F:

GGTAGTCYAYGCMSTAAACG

263

（Bachetal.2002）

1044R:

GACARCCATGCASCACCTG

表2PCR反应体系及程序：

TaKaRaTaq™Version2.0

12.5ul

模板

0.5ul

引物1

0.5ul

引物2

0.5ul

灭菌蒸馏水

11ul

共25ul

2.2.4.3扩增程序

qnrA：

94℃5min；94℃45s，54℃45s，72℃1min，35循环；终延伸72℃10min；qnrB和qnrS：

94℃5min；94℃45s，54℃45s，72℃1min，35循环；终延伸72℃10min；qnrC：

94℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃1min，35循环；qnrD：

94℃5min；94℃45s，54℃45s，72℃1min15s，35循环；qepA：

94℃

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