蛭弧菌高密度培养方法.docx

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蛭弧菌高密度培养方法

蛭弧菌高密度培养方法

一•大肠杆菌的发酵罐培养

1•斜面菌种制作：

培养基：

蛋白陈10g/L牛肉膏5g/L酵母粉（膏）5g/L葡萄糖5g/L氯化钠

5g/L琼脂15-2Og/LPH7.0-7.2

★方法1：

冻干管（青霉素瓶）中加入4ml生理盐水，震荡均匀制成菌悬液，转接于30m/150ml牛膏蛋白陈培养液中，37°C200rpm/min培养24hz用接种环划线于固体培养基上，37°C培养18-24h,选择表面光滑园整大小形态均一的多个单菌落接种于斜面其中22x200mm大斜面数十支:

一月生产用种）,15x150mm斜面4-5支作为保种,保种至少两种方式,2支液体矿油保种,2支甘油保种（每支斜面注入2-4ml生理盐水、无菌水或培养液刮洗菌苔，然后集中于灭菌空试管中，露荡均匀，另取含灭菌（至少两次）的浓度50%日油的溶液备用,取灭菌2ml离心管数个,分别用灭菌长径滴管吸取菌悬液0.8-0.9ml甘油浓度50%日油的溶液0.8-0.9ml注入离心管中,旋盖震荡均匀后置于-20冰箱保存（甘油管的多少根据月生产量而定,每月使用1-2支甘油管活化，划线取单菌落于生产斜面的制作，暂不进行保种）,—般保存6-12月,甘油冷冻保藏适用于好氧细菌和酵母菌中长期保存。

方法2:

取一支冻干管在无菌条件下用无菌吸管吸取0.3-0.5ml培养液，滴入内管内，轻微震荡（吸管协助），直到均匀制成菌悬液。

用无菌滴管吸取0.2-0.3ml菌悬液滴在两支空白斜面（18x180mm）上涂布（余下的菌悬液转接于4-5ml液体培养基中适温培养,镜检菌体个体形态等）,用接种环蘸去少量菌液在平板或茄型瓶（45-50ml/200ml）平面划线，挑取典型菌落（生长快菌落大）转接于斜面，37°C培养18-24h,再次转接于10支斜面,其中2-3支保种（至少两种保种方式），其余作为生产用种出发种。

生产使用大试管（22x200mm）,注入20ml培养基/支，棉塞牛皮纸扎好,高压灭菌30-40min,稍冷，摆放斜面12-24h,37°C空培24h,基本无冷凝水,无杂菌时方可转接,每支出发菌种转接20-30支,37°C培养18-24h,置于4-6°C冰箱保存备用，使用期不过30do

2.三角瓶培养：

培养基：

蛋白月东10g/L牛肉膏5g/L酵母粉（膏）5g/L葡萄糖5g/L氯化钠5g/L氯化披l.Og/L磷酸二氢钾3.0g/L磷酸二氢钠6.0g/LPH7.0-7.2

三角瓶培养:

4x200-250ml/1000ml三角瓶，八层纱布或棉塞密闭,高压灭菌待接。

取一支生产斜面试管,加灭菌自来水5ml,用接种环轻轻刮取菌苔,然后将倒入三角瓶中紗布密闭置于摇床上37°C180-200rpm/min培养12-16ho

3.种子罐培养（30L/50L）

3.1培养基：

蛋白月东15g/L牛肉膏5g/L酵母粉（膏）10g/L葡萄糖12g/L或甘油10ml/l氯化钠5g/L氯化披l.Og/L磷酸二氢钾3.0g/L磷酸二氢钠6.0g/L硫酸镁0.25g/LPH7.0-7.2

3.2准备材料：

消泡剂：

0.1-0.2%豆;由或0.01-0.03%泡敌，由于这些消泡剂难溶于水，使用前制成悬浊液,在0.5mpa,30min备用。

注：

开始培养时消泡剂少用。

可直接加入与培养基一起灭菌。

补料：

500g/l葡萄糖溶液或甘油，补加甘油培养液PH下降较慢。

酸碱调节剂：

20%氢氧化钠溶液或氨水，流加维持PH在7.0-7.43.3种子罐培养：

30L/50L种子罐l-3h迟缓期3-12h对数期13-18h稳定期

30L/50L种子罐,500ml/500ml补料瓶先用500ml/1000ml三角瓶高压灭菌,然后在无菌条件下转入灭菌的补料瓶。

补料培养基：

葡萄糖500g/l蛋白月东80g/l酵母膏50g/lMgS0410g/l

PH7.5-7.8（灭菌前）灭菌温度115°C30min

3.1通气量：

l-4h1:

0.5-0.65-7h1:

0.8-0.98-16h1:

1.0

溶氧量的变化：

通过搅拌和改变通气量控制溶氧量在20%以上。

培养8h左右溶氧突然升高,显示发酵液中的葡萄糖已经耗尽,随后PH开始升高（菌体利用乙酸）,加入葡萄糖后溶氧迅速下降。

3.2转速：

l-4h150r/min,5-16h180-200r/min,罐压保捋0.05mpao

3.3PH:

20%NaOH溶液或28%氨水调节，10%HCI溶液,酸碱瓶灭菌，酸碱液可不灭。

3.4消泡剂：

添加量：

泡敌（GPE聚醮型一聚氧乙烯氧丙烯甘油）0.01-0.02%（1.0ml/10L培养液），豆油0.10-0.15%宁少勿多。

3.5补料：

对数期前期补料,补料时间及补料量:

4-6h30ml/h90ml,7-12h50ml/h300ml,13-16h30ml/h120ml，总计510ml左右。

每小时分三次平均添加,即20min添加一次。

3.6移种与取样：

一般对数期后期移种,平板培养结合镜检

注：

培养3-12h对数生长期，8-12h菌体生长速率下降，适合移种。

4.发酵罐300L/500L发酵罐300L/500L种子罐，12L/20L补料罐补料培养基同种子罐补料培养基。

4.1通气量l-4h1:

0.5-0.6,5-15h1:

1.0,16-20hl:

0.6-0.8o21-24hl:

0.5-0.6

4.2擁：

l-4h150r/min5-15h200r/min16-20h160-180r/min,21-24h150r/min,罐压保持0.05mpa

4.3PH调节流加10%盐酸及20%NaOH溶液使种子罐的PH稳定在7.0-7.220%NaOH溶液（酸碱瓶灭菌，溶液最好灭菌）补加量一般4-6L（90ml/150ml发酵罐培养8h补加160g/l的NaOH溶液4.0L）.

4.4消泡剂：

添加量:

泡敌0.01-0.02%（1.0ml/10L培养液）豆油0.10-0.15%宁少勿多。

4.5接种量：

4-5%,较大接种量，种子液中含大量的水解酶类,利于对基质的利用,缩短延迟期，过高菌体生长过快，消耗大量营养，影响后期的生长。

4.6补料:

补料时间及补料量:

4-6h550ml/h1650mlf7-12h900ml/h5400ml,13-16h补料550ml/h2200mlz17-24h350ml/h2800mlz约12000ml.每小时分四次平均添加,即15min添加一次。

4.7孚L糖诱导液：

孚L糖200g/l，对数期中后期适合加乳糖对细胞诱导，即培养8-10h,葡萄糖消耗基本完毕,菌体生长缓慢，开始利用乙酸为碳源进行二次生长』匕时开始诱导，保存乳糖在培养液的浓度1.0g/l,持续诱导4-6h至发酵结束,诱导开始以后停止补糖，此阶段暂不做。

4.8放料与取样时机：

发酵液培养24h,取样染色镜检.对培养液灭活121°C30min

4.9分装:

用灭菌血清瓶分装菌液（8L/10L）或将在发酵罐灭活的大肠杆菌14000r/min离心分离15min得菌泥,灭菌自来水清洗2-3次,然后按1:

1加入灭菌自来水或生理盐水混均后置于4-6°C保存备用。

二噬菌蛭弧菌培养

1.工艺流程

冷冻管（5ml生理盐水或无菌水L30ml/150ml三角瓶-4x250ml/500ml三角瓶培养-4x51/101血清瓶或301/501种子罐-3001/5001发酵罐-检验~分装-调配-检测一包装出厂注：

冻干管活化后部分菌悬液保种用，生产用种一般使用保存种。

2・生产工艺

原材料，100ml浓缩宿主菌C600,蛭弧菌冻干管，氯化钙，氯化镁等。

2.1三角瓶培养

冷冻管活化及保种：

取冷冻管一支，加入4-5mL无菌水制成菌悬液,接种于灭菌自来水（5mlC600浓菌液）30ml/150ml三角瓶中,30-31°C150r/min44-48ho适度稀释（107108）双平板培养2-3d,取菌斑数量多且清晰的平板培养至融汇菌斑,分别用8-10ml灭菌自来水、1/500NB液或脱脂牛奶（冷冻干燥法保存）,浸泡2-3h,为提高浸泡效果可用接种针平板划线，制成菌悬液…在超净工作台上并酒精灯火焰封口条件下，用灭菌的长滴管吸取浸泡菌液转移至浓度50%甘油的溶液5ml/试管中，震荡摇匀，取灭菌2ml离心管数个，分别用灭菌长径滴管吸取菌悬液2.0ml注入离心管中，旋盖熹荡均匀后置于冰箱冷冻（-20°C）保存（甘油管的多少根据月生产量而定，每月使用1-2支甘油管活化）,生产用菌种的制备：

取多个融汇菌斑（无杂菌）平板，每个加入8-10ml1/500NB培养液,划线浸泡2-3h，吸取菌悬液集中于灭菌试管，根据一月内的生产用菌量确定菌悬液的量,用灭菌长滴管吸取菌悬液约2.0ml于灭菌2ml离心管中，旋盖露荡均匀后置于4-6°C冰箱保存。

4x250mL自来水/500mL三角瓶（20-30mg/l氯化钙，20-30mg/l氯化镁）,调PH7.2-7.5,于121°C高压灭菌30min,冷却后加入15mL灭菌的C600浓宿主菌,2.0ml（2ml离心管）蛭弧菌悬液,八层纱布扎好z25-30°C震荡培养30-35h即为种子液（对数期中、后期X

2.2血清瓶或301/501种子罐

10L血清瓶内装5L自来水（20-30mg/l氯化钙，20-30mg/l氯化镁），调PH7.2-7.5,于121°C灭菌30min,冷却后备用。

培养后的种子液按3-5%（250mL）接种量种入已灭菌血清瓶内，同时加入C600浓宿主菌150mL,并用八层纱布（灭菌）包扎瓶口，放入30°C恒温培养室内熹荡培养30-35h,

注若为产品培养时间适当延长至40・44h培养18・22h补加C600菌液50ml。

301/501种子罐培养:

宿主菌添加量：

3-5%即0.9-1.0L（宿主菌的起始浓度ICT-109cfu/ml）

消泡剂：

0.1-0.2%豆;由或0.01-0.02%泡敌（泡沬少适当减量1

接种量:

3-5%（lxl07cfu/ml）

通气量：

l-15h1:

0.3-0.5,16-35h1:

1.0。

溶氧量不低于20%（对氧的要求不太明显）

补料时间及补料（C600菌液）量:

18-22h20ml/h100mlf23-35h30ml/h390ml.约500ml.每小时分四次平均添加。

（海洋蛭弧菌经过大约13h的潜伏期后进入对数期）

转速：

l-15h50-60r/min,16-35h100-120r/mino罐压保持0.05mpa据资料介绍：

一般迟缓期l-13h,存在两次生长现象,—次14-27h呈对数期生长，二次35-45h对数期生长，期间稳定10h.

做试验检测培养过程中培养液的OD值不口PH的变化确定接种时机和补料时间。

2.3.3OOI/5OOI发酵罐:

宿主菌添加量9-10L（培养基中宿主菌的浓度106-109cfu/ml蛭弧菌均可生长,

高浓度宿主菌更利于生长），即10L培养液灭菌后静止沉淀，吸取上清液，保留1L沉淀菌液作为宿主菌的来源。

消泡剂：

0.1-0.2%豆;由或0.01-0.02%泡敌（lml/101）（泡沬少适当减量1

接种量：

4-5%（lxl07cfu/ml）

通气量：

l-15h1:

03-0.5,16-35h1:

1.0溶氧量20%•罐压0.05mpa.

补料时间及补料（C600菌液）量：

18-22h200ml/h1.0L,23-35h300ml/h

3.9L.36-48h150ml/h1.95L,约6.85L,每小时分四次平均添加。

转速：

l-15h50-60r/minz16-35h100-120r/min罐压保持0.05mpa

2.3成品配制

500L调配罐加入1.0L浓缩宿主菌C600,蛭弧菌培养液5.0L,滤菌水450L配制成大于107mL菌液，搅拌均匀后分装，随即加盖密封,成品检验合格后入库施

3.噬菌蛭弧菌检测方法

3.1.仪器与材料

天平灭菌器试管架150ml三角瓶电炉试管培养皿吸lml（lOml）培养箱

3.2.培养基和稀释液

321.底层培养基：

2.0%的水琼脂（10-12ml）322上层培养基：

0.5-0.6%的水琼脂（5-6ml）

323稀释液：

生理盐水（0.85-0.90%的氯化钠溶液）33操作步骤:

331•将准备好的吸管试管150ml三角瓶中装入99ml的稀释液（每样三个）大橡胶塞C600浓菌液待检测菌液带橡皮塞的小试管（可灭菌前注入4.5ml\

332•用灭菌的10ml的吸管吸取样品若干注入带橡胶塞的试管中备用,用大橡胶塞塞好原料瓶,包好放置一边。

3.3.3将灭菌的2.0%的培养基倒平板，放置冷却备用。

334•吸取试管中的样品1ml,注入99ml的稀释液的三角瓶中，混匀制成10'2的稀释液，依次用99ml的稀释液的三角瓶制成IO%10-6,用10ml吸管吸取0.85-0.90%的氯化钠溶液4.5ml注入试管中，吸取10,的稀释液0.5ml注入4.5ml的稀释液的试管中，混匀制成10-7的梯度稀释液。

335•吸取10-7稀释液lml汾别注入准备好的2%的水琼脂培养皿中0.5ml

（二次平行），将0.2ml大肠杆菌加入5-6ml已灭菌的0.6%的水琼脂小试管中，混合均匀后，45-50°C倒入上层培养基混匀，待凝固，倒置于培养箱中31°C培养48h计数。

34计算方法：

蛭弧菌数二两平板菌数和乘以107

蛭弧菌分离纯化及生长条件和裂解能力的研究

1•样本采隼:

虾池水、池塘底泥、虾池周围排水沟水等,样品冷藏至实验室。

试验前取出，若底泥取2-3g加20ml无菌水制备成悬液，吸取上清液过滤备用。

2•培养基:

自来水或天然陈海水琼脂，双层琼脂平板下层为1.0%上层为0.5%琼脂。

宿主菌培养基：

NB培养基蛋白籐10g/L酵母膏3g/LNaCl10-15g/LPH7.0-7.2蒸催水或天然海水。

TCBS培养基:

弧菌培养基蛋白陈10g/L酵母膏5g/L柠檬酸钠10g/L硫代硫酸钠10g/L蔗糖20g/L牛胆盐8g/LNaCl10g/L柠檬酸铁10g/L漠麝香草酚蓝0.04g/L（1%1.0ml）麝香草酚兰0.04g/L琼脂粉12g/LPH8.6

（弧菌总数计数）广州环凯生物科技开发公司

浸出液：

1/10YP浸出液即酵母膏0.03g/L蛋白陈0.006g/L用于将蛭弧菌从平板中浸出。

3.宿主菌及菌悬液制备

用于分离培养计数蛭弧菌宿主菌六株：

副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、施阳段单胞菌、大肠杆菌等。

宿主菌菌悬液制备：

（培养基中宿主菌的浓度106-109cfu/ml蛭弧菌均可生长,高浓度宿主菌更利于生长）

斜面活化：

转接于斜面30-37°C培养18-24h,取一支斜面,加入2-4ml无菌水或生理盐水刮洗菌苔制得菌悬液，接入50ml/250ml三角瓶中，30-37°C摇床培养18-24h,或将宿主菌接种于NB固体平板30-37°C培养24h,用4ml无菌水洗脱（每个平板的菌液收集到两个EP管中），将培养液4000r/min离心30min或灭活自然沉降24h去上清液，沉淀菌体用生理盐水洗一次，最好再离心一次，去上清液,加入生理盐水制备成宿主菌悬液,4°C冰箱保存备用。

4•富集培养

10ml水样或2-3g底泥加入15ml灭菌海水或自来水混合均匀，静止2-3h,过滤液加入90ml灭菌自来水或海水/250ml三角瓶加入5-10ml浓宿主菌液:

死活菌均可），使培养液中菌浓度108cfu/ml,八层纱布扎紧,28-30°C震荡培养24-48h,反复培养两次备用。

注：

虾池水、排水沟水富集培养后菌斑数量高于直接培养，池底泥反而减少。

5•分离纯化

双舷分离法:

取富集液1.0ml梯度稀释至10-510-610-7,将1.0%海水或自来水琼脂注入无菌平皿（10-12ml）,静置2-3h,然后将上层海水或自来水琼脂溶解后分装试管（5ml/只灭菌后）置于45-50°C水浴锅中,将0.2ml浓宿主菌，0.5ml蛭弧菌稀释液,使宿主菌浓菌液浓度108cfu/ml）z充分混均，趁热注入下层培养基上，左右各旋转几次,25-30°C倒置培养淡水3-5d,海水5-7d,从第二天连续观察。

双层琼脂平板法培养蛭弧菌,24h有菌斑出现，一般48-72h（海水型4-5d）出斑率高,直到5-7d,出现几种不同类型的斑，多数呈圆形,菌斑清晰,边缘整齐透明，菌斑大小随时间延长而增大并相互融合变得模糊。

热死菌悬液出斑时间短（48h出斑）,菌斑清晰。

在热死宿主菌生长蛭弧菌,再接种于活的宿主菌琼脂平板仍能恢复其生长持性和裂解活力。

菌矽化：

选择出斑数在30-50个菌斑的平板（预备试验）,用接种环挖出不同类形单菌斑置于2ml灭菌自来水或海水（1/10YP或1/500NB冲震荡均匀后于28-30°C浸泡6-8h或依上述方法培养，然后用浸出液梯度稀释作平板，28°C2-3d形成二代菌斑，三代菌斑，当菌斑形态大小基本一致，取多个纯化菌斑置于4.0-6.0°C条件下鮪。

选斑的原则：

根据出斑快慢、大小、形态、清晰度和色素等进行归类,采取单斑传代,每类菌斑至少制徹菌斑数的60-70%,即选取20-25个菌斑。

6.蛭弧菌筛选即裂解能力研究

蛭弧菌主要裂解革蓝氏阴性菌和部分阳性菌,选取不同的宿主菌即水产病源微生物，依上述试验步骤进行双平板培养，观察出斑数量，快慢,大小,清晰度，选择出斑数量多的菌株作为目标菌。

目标菌的原则：

对一种、几种或全部病源微生物敏感即菌斑数量多的，都作为目标菌保存。

7•液体増殖试验：

95ml无菌水或陈海水/250ml

蛭弧囲液

5ml蛭弧菌浸出液f

25-28°C110r/min

0.2ml宿主浓菌液

2-3d（海水型3-5d）

（施氏假单胞菌）

PH7.4-7.6

八层纱布扎口

菌液10倍稀释计数。

象其它细菌一样需要适量的NaCl保持渗透压外,还需要一定钙镁离子，当使

用自来水培养基时水中含阳离子的浓度基本保证蛭弧菌的需要，海水种应考虑盐类作用。

天然海水作培养基比人工配制蛭弧菌的检出率高10倍，天然海水中存在不明促进因子。

7•稳定性试验

取筛选后的目标菌液体培养3-5代，然后逬行双平板裂解试验，最后确定目标菌

2-3株保存备用。

8.菌株安全性试验及鉴定

送科硏院所分子学鉴定

9.蛭弧菌培养物保存（另文）

短期采用自来水或1/500NB保护液法,中长期采用甘油保存法（20-30%）.