蛭弧菌高密度培养方法.docx

1、蛭弧菌高密度培养方法蛭弧菌高密度培养方法一 大肠杆菌的发酵罐培养1斜面菌种制作： 培养基：蛋白陈10g/L牛肉膏5g/L酵母粉（膏）5g/L葡萄糖5g/L氯化钠5g/L 琼脂 15-2Og/L PH7.0-7.2方法1 ：冻干管（青霉素瓶）中加入4ml生理盐水，震荡均匀制成菌悬液， 转接于30m/150ml牛膏蛋白陈培养液中，37C 200rpm/min培养24h z用 接种环划线于固体培养基上，37C培养18-24h ,选择表面光滑园整大小形态 均一的多个单菌落接种于斜面其中22x200mm大斜面数十支:一月生产用种）, 15x150mm斜面4-5支作为保种,保种至少两种方式,2支液体矿油保

2、种,2 支甘油保种（每支斜面注入2-4ml生理盐水、无菌水或培养液刮洗菌苔，然后 集中于灭菌空试管中，露荡均匀，另取含灭菌（至少两次）的浓度50%日油的 溶液备用,取灭菌2ml离心管数个,分别用灭菌长径滴管吸取菌悬液0.8-0.9ml 甘油浓度50%日油的溶液0.8-0.9ml注入离心管中,旋盖震荡均匀后置于-20 冰箱保存（甘油管的多少根据月生产量而定,每月使用1-2支甘油管活化，划线 取单菌落于生产斜面的制作，暂不进行保种）,般保存6-12月,甘油冷冻保 藏适用于好氧细菌和酵母菌中长期保存。方法2 :取一支冻干管在无菌条件下用无菌吸管吸取0.3-0.5 ml培养液，滴入 内管内，轻微震荡（

3、吸管协助），直到均匀制成菌悬液。用无菌滴管吸取0.2-0.3ml 菌悬液滴在两支空白斜面（18x180mm ）上涂布（余下的菌悬液转接于4-5ml 液体培养基中适温培养,镜检菌体个体形态等）,用接种环蘸去少量菌液在平板 或茄型瓶（45-50ml/200ml ）平面划线，挑取典型菌落（生长快菌落大）转接 于斜面，37C培养18-24h ,再次转接于10支斜面,其中2-3支保种（至少两 种保种方式），其余作为生产用种出发种。生产使用大试管（22x200mm ）,注 入20ml培养基/支，棉塞牛皮纸扎好,高压灭菌30-40min ,稍冷，摆放斜面 12-24h , 37C空培24h ,基本无冷凝水,

4、无杂菌时方可转接,每支出发菌种转 接20-30支,37C培养18-24h ,置于4-6C冰箱保存备用，使用期不过30do2.三角瓶培养：培养基：蛋白月东10g/L牛肉膏5g/L酵母粉（膏）5g/L葡萄糖5g/L氯化钠 5g/L氯化披l.Og/L磷酸二氢钾3.0g/L磷酸二氢钠6.0g/L PH7.0-7.2三角瓶培养:4x200-250ml/1000ml三角瓶，八层纱布或棉塞密闭,高压灭菌 待接。取一支生产斜面试管,加灭菌自来水5ml ,用接种环轻轻刮取菌苔,然后 将倒入三角瓶中紗布密闭置于摇床上37C 180-200rpm/min培养12-16ho3.种子罐培养（30 L /50L ）3.1

5、培养基：蛋白月东15g/L牛肉膏5g/L酵母粉（膏）10g/L葡萄糖12g/L或 甘油10ml/l氯化钠5g/L氯化披l.Og/L磷酸二氢钾3.0g/L磷酸二氢钠 6.0g/L 硫酸镁 0.25 g/L PH7.0-7.23.2准备材料：消泡剂：0.1-0.2%豆;由或0.01-0.03%泡敌，由于这些消泡剂难溶于水，使用 前制成悬浊液,在0.5mpa , 30 min备用。注：开始培养时消泡剂少用。可直 接加入与培养基一起灭菌。补料：500g/l葡萄糖溶液或甘油，补加甘油培养液PH下降较慢。酸碱调节剂：20%氢氧化钠溶液或氨水，流加维持PH在7.0-7.4 3.3种子罐培养：30L/50L种

6、子罐 l-3h迟缓期 3-12h对数期 13-18h稳定期30L/50L种子罐,500ml/500ml补料瓶先用500ml/1000ml三角瓶高压灭菌, 然后在无菌条件下转入灭菌的补料瓶。补料培养基：葡萄糖500g/l蛋白月东80g/l酵母膏50g/l MgS04 10g/lPH7.5-7.8 （灭菌前）灭菌温度115C 30min3.1通气量：l-4h 1:0.5-0.6 5-7h 1:0.8-0.9 8-16h 1:1.0溶氧量的变化：通过搅拌和改变通气量控制溶氧量在20%以上。培养8h左右 溶氧突然升高,显示发酵液中的葡萄糖已经耗尽,随后PH开始升高（菌体利用 乙酸）,加入葡萄糖后溶氧迅

7、速下降。3.2转速：l-4h 150r/min , 5-16h 180-200r/min ,罐压保捋 0.05mpao3.3PH : 20%NaOH溶液或28%氨水调节，10%HCI溶液,酸碱瓶灭菌，酸碱 液可不灭。3.4消泡剂：添加量：泡敌（GPE聚醮型一聚氧乙烯氧丙烯甘油）0.01-0.02% （1.0ml/10L 培养液），豆油0.10-0.15%宁少勿多。3.5补料：对数期前期补料,补料时间及补料量:4-6h 30ml/h 90ml , 7-12h 50ml/h 300ml, 13-16h 30ml/h 120ml，总计 510ml 左右。每小时分三次平 均添加,即20min添加一次。

8、3.6移种与取样：一般对数期后期移种,平板培养结合镜检注：培养3-12h对数生长期，8-12h菌体生长速率下降，适合移种。4.发酵罐300L/500L发酵罐 300L/500L种子罐，12L/20L补料罐 补料培养基同种子罐补料培养基。4.1通气量 l-4h 1:0.5-0.6 ,5-15h 1:1.0 ,16-20h l:0.6-0.8o21-24h l:0.5-0.64.2擁：l-4h 150r/min 5-15h 200r/min 16-20h 160-180r/min, 21-24h 150r/min ,罐压保持 0.05mpa4.3PH调节 流加10%盐酸及20%NaOH溶液使种子罐

9、的PH稳定在7.0-7.2 20%NaOH溶液（酸碱瓶灭菌，溶液最好灭菌）补加量一般4-6L（ 90ml/150ml 发酵罐培养8h补加160g/l的NaOH溶液4.0L ）.4.4消泡剂：添加量:泡敌0.01-0.02%（ 1.0ml/10L培养液）豆油0.10-0.15% 宁少勿多。4.5接种量：4-5% ,较大接种量，种子液中含大量的水解酶类,利于对基质的 利用,缩短延迟期，过高菌体生长过快，消耗大量营养，影响后期的生长。4.6 补料:补料时间及补料量:4-6h 550ml/h 1650ml f 7-12h 900ml/h 5400ml , 13-16h 补料 550ml/h 2200m

10、l z 17-24 h 350ml/h 2800ml z 约 12000ml.每小时分四次平均添加,即15min添加一次。4.7孚L糖诱导液：孚L糖200g/l，对数期中后期适合加乳糖对细胞诱导，即培养 8-10h ,葡萄糖消耗基本完毕,菌体生长缓慢，开始利用乙酸为碳源进行二次生 长匕时开始诱导，保存乳糖在培养液的浓度1.0g/l ,持续诱导4-6h至发酵结 束,诱导开始以后停止补糖，此阶段暂不做。4.8放料与取样时机：发酵液培养24h ,取样染色镜检.对培养液灭活121C 30min4.9分装:用灭菌血清瓶分装菌液（8L/10L）或将在发酵罐灭活的大肠杆菌14000 r/min离心分离15m

11、in得菌泥,灭菌自来水清洗2-3次,然后按1:1加入灭菌 自来水或生理盐水混均后置于4-6C保存备用。二噬菌蛭弧菌培养1.工艺流程冷冻管（5ml生理盐水或无菌水L30ml/150ml三角瓶-4x250ml/500ml三角 瓶培养-4x51/101血清瓶或301/501种子罐-3001/5001发酵罐-检验分装- 调配-检测一包装出厂 注：冻干管活化后部分菌悬液保种用，生产用种一般使 用保存种。2生产工艺原材料，100ml浓缩宿主菌C600,蛭弧菌冻干管，氯化钙，氯化镁等。2.1三角瓶培养冷冻管活化及保种：取冷冻管一支，加入4-5mL无菌水制成菌悬液,接种于灭 菌自来水（5mlC600 浓菌液）

12、30ml/150ml 三角瓶中,30-31C 150r/min 44-48ho适度稀释（107 108 ）双平板培养2-3d ,取菌斑数量多且清晰的平板 培养至融汇菌斑,分别用8-10ml灭菌自来水、1/500NB液或脱脂牛奶（冷冻 干燥法保存）,浸泡2-3h ,为提高浸泡效果可用接种针平板划线，制成菌悬液 在超净工作台上并酒精灯火焰封口条件下，用灭菌的长滴管吸取浸泡菌液转移至 浓度50%甘油的溶液5ml/试管中，震荡摇匀，取灭菌2ml离心管数个，分别 用灭菌长径滴管吸取菌悬液2.0ml注入离心管中，旋盖熹荡均匀后置于冰箱冷 冻（-20C ）保存（甘油管的多少根据月生产量而定，每月使用1-2支

13、甘油管活 化）,生产用菌种的制备：取多个融汇菌斑（无杂菌）平板，每个加入8-10ml 1/500NB培养液,划线浸泡2-3h，吸取菌悬液集中于灭菌试管，根据一月内的 生产用菌量确定菌悬液的量,用灭菌长滴管吸取菌悬液约2.0ml于灭菌2ml离 心管中，旋盖露荡均匀后置于4-6C冰箱保存。4x 250mL自来水/500mL三角瓶（20-30mg/l氯化钙，20-30mg/l氯化镁）, 调PH7.2-7.5 ,于121C高压灭菌30min ,冷却后加入15mL灭菌的C600浓 宿主菌,2.0ml （ 2ml离心管）蛭弧菌悬液,八层纱布扎好z 25-30C震荡培养 30-35 h即为种子液（对数期中、

14、后期X2.2血清瓶或301/501种子罐10L血清瓶内装5L自来水（20-30mg/l氯化钙，20-30mg/l氯化镁），调 PH7.2-7.5 ,于121C灭菌30min ,冷却后备用。培养后的种子液按3-5%（ 250mL ）接种量种入已灭菌血清瓶内，同时加入C600 浓宿主菌150mL ,并用八层纱布（灭菌）包扎瓶口，放入30C恒温培养室内熹 荡培养30-35h ,注若为产品培养时间适当延长至4044h培养1822h补加C600菌液50ml。301/501种子罐培养:宿主菌添加量：3-5%即0.9-1.0L （宿主菌的起始浓度ICT -109 cfu/ml）消泡剂：0.1-0.2%豆;由

15、或0.01-0.02%泡敌（泡沬少适当减量1接种量:3-5% （lxl07cfu/ml）通气量：l-15h 1:0.3-0.5 , 16-35h 1:1.0。溶氧量不低于20% （对氧的要求 不太明显）补料时间及补料（C600 菌液）量:18-22h 20ml/h 100ml f 23-35h 30ml/h 390ml.约500ml.每小时分四次平均添加。（海洋蛭弧菌经过大约13h的潜伏 期后进入对数期）转速：l-15h 50-60r/min , 16-35h 100-120r/mino 罐压保持 0.05mpa 据资料介绍：一般迟缓期l-13h ,存在两次生长现象,次14-27 h呈对数期

16、生长，二次35-45h对数期生长，期间稳定10h.做试验检测培养过程中培养液的OD值不口 PH的变化确定接种时机和补料时间。2.3. 3OOI/5OOI 发酵罐:宿主菌添加量9-10L（培养基中宿主菌的浓度106-109cfu/ml蛭弧菌均可生长,高浓度宿主菌更利于生长），即10L培养液灭菌后静止沉淀，吸取上清液，保留 1L沉淀菌液作为宿主菌的来源。消泡剂：0.1-0.2%豆;由或0.01-0.02%泡敌（lml/101）（泡沬少适当减量1接种量：4-5% （lxl07cfu/ml）通气量：l-15h 1:03-0.5 , 16-35h 1:1.0 溶氧量 20%罐压 0.05mpa.补料时间

17、及补料（C600 菌液）量：18-22h 200ml/h 1.0L , 23-35h 300ml/h3.9 L. 36-48h 150ml/h 1.95L,约6.85 L,每小时分四次平均添加。转速：l-15h 50-60r/min z 16-35h 100-120r/min 罐压保持 0.05mpa2.3成品配制500L调配罐加入1.0L浓缩宿主菌C600 ,蛭弧菌培养液5.0L ,滤菌水450L 配制成大于107mL菌液，搅拌均匀后分装，随即加盖密封,成品检验合格后入 库施3.噬菌蛭弧菌检测方法3.1.仪器与材料天平灭菌器试管架150ml三角瓶电炉试管培养皿吸lml（lOml）培养箱3.2

18、.培养基和稀释液321.底层培养基：2.0%的水琼脂（10-12ml） 322上层培养基：0.5-0.6%的水琼脂（5-6ml ）323稀释液：生理盐水（0.85-0.90%的氯化钠溶液） 33操作步骤:331将准备好的吸管 试管150ml三角瓶中装入99ml的稀释液（每样三个） 大橡胶塞C600浓菌液 待检测菌液 带橡皮塞的小试管（可灭菌前注入 4.5ml 332用灭菌的10ml的吸管吸取样品若干注入带橡胶塞的试管中备用,用大橡 胶塞塞好原料瓶,包好放置一边。3.3.3将灭菌的2.0%的培养基倒平板，放置冷却备用。334吸取试管中的样品1ml ,注入99ml的稀释液的三角瓶中，混匀制成102

19、 的稀释液，依次用99ml的稀释液的三角瓶制成IO% 10-6,用10ml吸管吸取 0.85-0.90%的氯化钠溶液4.5ml注入试管中，吸取10,的稀释液0.5ml注入 4.5ml的稀释液的试管中，混匀制成10-7的梯度稀释液。335吸取10-7稀释液lml汾别注入准备好的2%的水琼脂培养皿中0.5ml（二次平行），将0.2ml大肠杆菌加入5-6ml已灭菌的0.6%的水琼脂小试管 中，混合均匀后，45-50C倒入上层培养基混匀，待凝固，倒置于培养箱中31C 培养48h计数。34计算方法：蛭弧菌数二两平板菌数和乘以107蛭弧菌分离纯化及生长条件和裂解能力的研究1样本采隼:虾池水、池塘底泥、虾池

20、周围排水沟水等,样品冷藏至实验室。试 验前取出，若底泥取2-3g加20ml无菌水制备成悬液，吸取上清液过滤备用。2培养基:自来水或天然陈海水琼脂，双层琼脂平板下层为1.0%上层为0.5% 琼脂。宿主菌培养基：NB培养基 蛋白籐10g/L酵母膏3g/L NaCl 10-15g/L PH7.0-7.2蒸催水或天然海水。TCBS培养基:弧菌培养基蛋白陈10g/L酵母膏5g/L柠檬酸钠10g/L硫代硫 酸钠10g/L蔗糖20g/L牛胆盐8g/L NaCl 10g/L柠檬酸铁10g/L漠麝香草 酚蓝 0.04g/L （1% 1.0ml）麝香草酚兰 0.04g/L 琼脂粉 12g/L PH 8.6（弧菌总

21、数计数）广州环凯生物科技开发公司浸出液：1/10YP浸出液即 酵母膏0.03g/L蛋白陈0.006g/L用于将蛭弧菌从 平板中浸出。3.宿主菌及菌悬液制备用于分离培养计数蛭弧菌宿主菌六株：副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、嗜水气 单胞菌、施阳段单胞菌、大肠杆菌等。宿主菌菌悬液制备：（培养基中宿主菌的浓度106-109 cfu/ml蛭弧菌均可生长, 高浓度宿主菌更利于生长）斜面活化：转接于斜面30-37C培养18-24h ,取一支斜面,加入2-4ml无菌水 或生理盐水刮洗菌苔制得菌悬液，接入50ml/250ml三角瓶中，30-37C摇床培 养18-24h ,或将宿主菌接种于NB固体平板30-37C培

22、养24h ,用4ml无菌水 洗脱（每个平板的菌液收集到两个EP管中），将培养液4000r/min离心30min 或灭活自然沉降24h去上清液，沉淀菌体用生理盐水洗一次，最好再离心一次， 去上清液,加入生理盐水制备成宿主菌悬液,4C冰箱保存备用。4富集培养10ml水样或2-3g底泥加入15ml灭菌海水或自来水混合均匀，静止2-3h ,过 滤液加入90ml灭菌自来水或海水/250ml三角瓶加入5-10 ml浓宿主菌液:死 活菌均可），使培养液中菌浓度108cfu/ml ,八层纱布扎紧,28-30C震荡培养 24-48h ,反复培养两次备用。注：虾池水、排水沟水富集培养后菌斑数量高于直接培养，池底泥

23、反而减少。5分离纯化双舷分离法:取富集液1.0ml梯度稀释至10-510-610-7 ,将1.0%海水或自来水琼脂注入无 菌平皿（10-12 ml）,静置2-3h ,然后将上层海水或自来水琼脂溶解后分装试 管（5ml/只灭菌后）置于45-50C水浴锅中,将0.2ml浓宿主菌，0.5ml蛭弧 菌稀释液,使宿主菌浓菌液浓度108cfu/ml ）z充分混均，趁热注入下层培养基 上，左右各旋转几次,25-30C倒置培养淡水3-5d ,海水5-7d ,从第二天连 续观察。双层琼脂平板法培养蛭弧菌,24h有菌斑出现，一般48-72h （海水型 4-5d ）出斑率高,直到5-7d ,出现几种不同类型的斑，多

24、数呈圆形,菌斑清晰, 边缘整齐透明，菌斑大小随时间延长而增大并相互融合变得模糊。热死菌悬液出 斑时间短（48h出斑）,菌斑清晰。在热死宿主菌生长蛭弧菌,再接种于活的宿 主菌琼脂平板仍能恢复其生长持性和裂解活力。菌矽化：选择出斑数在30-50个菌斑的平板（预备试验）,用接种环挖出不同类形单菌 斑置于2 ml灭菌自来水或海水（1/10YP或1/500NB冲 震荡均匀后于28-30C 浸泡6-8h或依上述方法培养，然后用浸出液梯度稀释作平板，28C 2-3d形成 二代菌斑，三代菌斑，当菌斑形态大小基本一致，取多个纯化菌斑置于4.0-6.0C 条件下鮪。选斑的原则：根据出斑快慢、大小、形态、清晰度和色

25、素等进行归类,采取单斑 传代,每类菌斑至少制徹菌斑数的60-70% ,即选取20-25个菌斑。6.蛭弧菌筛选即裂解能力研究蛭弧菌主要裂解革蓝氏阴性菌和部分阳性菌,选取不同的宿主菌即水产病源微生 物，依上述试验步骤进行双平板培养，观察出斑数量，快慢,大小,清晰度，选 择出斑数量多的菌株作为目标菌。目标菌的原则：对一种、几种或全部病源微生物敏感即菌斑数量多的，都作为目 标菌保存。7液体増殖试验：95ml无菌水或陈海水/250ml蛭弧囲液5ml蛭弧菌浸出液 f25-28C110 r/min0.2ml宿主浓菌液2-3d （海水型 3-5d ）（施氏假单胞菌）PH7.4-7.6八层纱布扎口菌液10倍稀释计数。象其它细菌一样需要适量的NaCl保持渗透压外,还需要一定钙镁离子，当使用自来水培养基时水中含阳离子的浓度基本保证蛭弧菌的需要，海水种应考虑盐 类作用。天然海水作培养基比人工配制蛭弧菌的检出率高10倍，天然海水中存 在不明促进因子。7 稳定性试验取筛选后的目标菌液体培养3-5代，然后逬行双平板裂解试验，最后确定目标菌2-3株保存备用。8.菌株安全性试验及鉴定送科硏院所分子学鉴定9.蛭弧菌培养物保存(另文)短期采用自来水或1/500NB保护液法,中长期采用甘油保存法(20-30% ).