益肾填精补钙壮骨中药复方对骨形成蛋白4诱导成骨信号转导机制的调控作用.docx

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益肾填精补钙壮骨中药复方对骨形成蛋白4诱导成骨信号转导机制的调控作用

益肾填精、补钙壮骨中药复方对骨形成蛋白-4诱导成骨信号转导机制的调控作用

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

【摘要】目的研究益肾填精、补钙壮骨中药复方对骨形成蛋白-4（BMP-4）诱导成骨信号转导机制的调控作用。

方法将雌性Wistar大鼠随机分为7组：

正常组、模型空白组、牡蛎钙补肾中药复方低剂量组、牡蛎钙补肾中药复方中剂量组、牡蛎钙补肾中药复方高剂量组、骨疏康颗粒组、牡蛎碳酸钙咀嚼片组。

采用切除大鼠双侧卵巢的方法复制绝经后骨质疏松症模型,应用益肾填精、补钙壮骨中药复方防治12周后进行取材及实验指标检测：

用双能X线骨密度仪检测股骨骨密度；用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测大鼠骨组织BMP-4和Smad5、6mRNA表达。

结果与模型空白组比较,中药复方各剂量组股骨骨密度显著升高（P＜0.01）；骨组织BMP-4、Smad5mRNA表达水平明显升高（P＜0.01）,Smad6mRNA表达水平明显降低（P＜0.01）。

结论益肾填精、补钙壮骨中药复方可明显上调BMP-4和Smad5mRNA表达,下调Smad6mRNA表达。

【关键词】骨质疏松症；骨形成蛋白-4；信号转导；Smads蛋白Abstract：

ObjectiveTostudytheregulatingeffectofcomplementingcalciumandinvigoratingkidneymethodonthebonemorphogeneticprotein-4（BMP-4）andsignaltransductionmechanism.MethodsFemaleWistarratswererandomlydividedintosevengroups：

normalgroup,modelgroup,low-,middle-,high-doseystercalciumcompoundChinesemedicineforreinforcingkidneygroup,Gushukanggranulegroup,oystershellcalciumtabletsgroup.Themodelofpostmenopausalosteoporosiswasestablishedthroughovariectomyinrats.TheosteoporosisratsweretreatedwithnanometercalciumandinvigoratingkidneyChinesemedicineGushukanggranule,andoystershellcarbonatechewabletabletswereusedaspositive-controlgroups,thenormalratsasstandardcontrol,andthemodelratsasmodelcontrol.After12weeksofthetreatment,theindexesweretested.Thebonemineraldensity（BMD）offemoralboneinvitrowasdetectedbydual-energyX-raydensitometerandtheexpressionofBMP-4andSmad5,6mRNAweredetectedbyreversetranscription-polymerasechainreation（RT-PCR）.ResultsComparedwiththemodelrats,BMDoffemoralboneinChinesemedicinegroups（highdose,middledose,lowdose）increasedobviously（P＜0.01）.TheexpressionofBMP-4andSmad5mRNAincreasedobviously（P＜0.01）,andtheexpressionofSmad6mRNAdecreasedobviously（P＜0.01）.ConclusionsNanometercalciumandinvigoratingkidneyChinesemedicinecanincreasetheexpressionofBMP-4andSmad5mRNA,anddecreasetheexpressionofSmad6mRNA.Keywords：

osteoporosis；bonemorphogeneticprotein-4；signaltransduction；Smadsprotein骨质疏松症是一种全身代谢性疾病,其病理机制十分复杂,是由多种细胞、激素和生长因子参与、互相交织而成的复杂网络。

骨局部生长因子以自分泌和旁分泌的形式直接作用于骨细胞,能促进细胞增殖、分化及基质合成,对骨折修复的启动、发育、调控及塑形均有重要作用[1]。

在众多骨生长因子中,骨形成蛋白（BMP）最受瞩目,它与骨诱导关系最为密切。

在BMPs诱导骨形成过程中,BMP-Smad信号转导通路是最主要的信号通路。

本研究通过检测去卵巢大鼠BMP-4及其受体调节性Smad5、抑制性Smad6信号转导因子的基因表达变化,探讨益肾填精、补钙壮骨中药复方对BMPs诱导成骨信号转导机制的调控作用。

现报道如下。

　　1实验材料　　1.1动物雌性Wistar大鼠105只,体重240～270g,4.5月龄,未曾交配,购自中国医科大学实验动物中心。

动物合格证号：

SCXK（辽）2003-0009号。

　　1.2试剂抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）测试盒（南京建成生物工程研究所,批号20050316）。

100bpDNALadderMarker（TaKaRa公司）,BMP-4,Smad5、6,β-actin引物（由TaKaRa公司合成）,TaKaRaRNAPCRKit（AMV）Ver.3.0试剂盒（TaKaRa公司）。

　　1.3仪器XR-36型双能X线骨密度仪（美国,NORLAND）,BiometraPCR扩增仪（德国）,DU640核酸蛋白分析仪（美国,Beckman）,ChemiImager5500凝胶电泳成像分析系统（美国,AlphaInnotech）。

　　1.4药物益肾填精、补钙壮骨中药复方制备：

取长山岛大连湾牡蛎,洗净,晒干。

采用纳米制备技术粉碎,最终平均粒径达到780nm左右,小于100nm的粒径占10%左右。

在制备过程中采取封闭和在线监测等措施避免颗粒污染和保证合适的颗粒尺寸分布。

所得牡蛎钙微粒与补肾中药（鹿茸等）微粉按照1∶1的比例混合,即得本实验用中药复方。

牡蛎碳酸钙咀嚼片（东盛科技启东盖天力制药股份有限公司,国药准字：

H32025394）。

骨疏康颗粒（东港市康辰制药有限公司,国药准字：

ZF20000347）。

　　2实验方法　　2.1分组及造模将实验动物按体重分层随机分为7组：

正常组、模型空白组、牡蛎钙补肾中药复方低剂量组、牡蛎钙补肾中药复方中剂量组、牡蛎钙补肾中药复方高剂量组、骨疏康颗粒组、牡蛎碳酸钙咀嚼片组（以下简称为正常组、模空组、实验低剂量组、实验中剂量组、实验高剂量组、骨疏康组、牡蛎碳酸钙组）,每组15只。

除正常组外,余者进行造模处理,大鼠经腹腔注射盐酸氯胺酮0.2mL/250g进行麻醉,将之以俯卧姿势固定于自制手术架上,从大鼠髂嵴顶部外上方1cm左右,腰椎骶棘肌两侧入路切除大鼠双侧卵巢,术后肌肉注射青霉素0.4mL/250g,连续3d。

　　2.2给药造模10d后开始给药。

实验低剂量组给药量为每日0.7g/kg,实验中剂量组为每日2.1g/kg,实验高剂量组为每日6.3g/kg,骨疏康组为每日2.1g/kg,牡蛎碳酸钙组为每日0.0063g/kg。

灌胃,每日1次,各组给药容积为100g体重1mL。

正常组、模空组每日灌胃等体积的生理盐水,每日上午给药,连续给药12周。

存活动物在最后一次给药后24h处死,并采集标本进行测定分析。

　　2.3大鼠离体股骨骨密度的测定应用XR-36型双能X线骨密度仪及其所附软件,测量离体左后肢股骨骨密度,组内变异系数（CV）在0.82%～1.24%。

　　2.4大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性检测采用酶动力学方法检测血清TRAP,按试剂盒说明进行操作。

　　2.5骨组织骨形成蛋白-4mRNA的检测　　在无菌条件下,取每组动物右后肢股骨干骺端,仔细剥离附着的肌肉、结缔组织,用0.1%DEPC水处理的铝箔纸包好,做好标记,立即放入液氮罐中。

置-70℃冰箱冻存备用。

分别取各组实验动物右后肢股骨干骺端约50～100mg大小,置入研磨管中,加1mLTrizol,采用RT-PCR方法进行BMP-4mRNA的检测。

BMP-4引物利用primer3软件设计,上游引物：

5’-AGAGCCAACACTGTGAGGA-3’；下游引物：

5’-TGTCCAGGCACCATTTCT-3’；扩增片段长度为245bp。

以β-actin基因作为PCR的内参照,上游引物：

5’-GCCAACCGTGAAAAGATG-3’；下游引物：

5’-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3’；扩增片段长度为700bp。

PCR反应完成后取8μLPCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,用自动凝胶电泳成像分析系统进行摄像、分析,测定电泳条带吸光度值,以β-actin为内参照,取BMP-4mRNA与β-actin比值,对产物进行相对定量。

　　2.6骨组织Smad5、6mRNA的检测Smad5引物利用primer3软件设计,上游引物：

5’-ACCCTGCCAATAACAAGA-3’；下游引物：

5’-GGACTTTATCCAGCCACT-3’；扩增片段长度为450bp。

以β-actin基因作为PCR的内参照,上游引物：

5’-GCCAACCGTGAAAAGATG-3’；下游引物：

5’-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3’；扩增片段长度为700bp。

Smad6引物利用primer3软件设计,上游引物：

5’-GCTCAAGCGGCTCAAGGA-3’；下游引物：

5’-CGCCCACTGTGACCAGTAAGGA-3’；扩增片段长度为451bp。

以β-actin基因作为PCR的内参照,上游引物：

5’-GCCAACCGTGAAAAGATG-3’；下游引物：

5’-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3’；扩增片段长度为700bp。

　　3统计学方法数据用SPSS15.0统计软件进行分析。

结果以x±s表示,对各组数据行方差分析和组间比较（方差齐用LSD检验,不齐用Games-Howell检验）,P＜O.05为差异有统计学意义。

　　4结果　　（见表1、表2及图1～图4）表1各组大鼠离体股骨骨密度的比较（略）注：

与模空组比较,*P＜0.05,**P＜0.01；与正常组比较,△△P＜0.01；与牡蛎碳酸钙组比较,☆P＜0.05,☆☆P＜0.01；与骨疏康组比较,□□P＜0.01；与实验高剂量组比较,◆◆P＜0.01（下同）表2各组大鼠血清TRAP活性比较（略）注：

1.正常组；2.模空组；3.实验低剂量组；4.实验中剂量组；　　5讨论　　5.1益肾填精、补钙壮骨中药复方对骨代谢及骨密度的影响本实验通过检测大鼠血清TRAP活性,观察益肾填精、补钙壮骨中药复方对骨吸收代谢的影响。

实验结果表明,实验各剂量组均能降低绝经后骨质疏松症大鼠的骨吸收代谢水平,而且实验低剂量和中剂量组作用优于阳性对照组。

本实验DEXA骨密度检测结果显示,实验各剂量组均能显著提高绝经后骨质疏松症大鼠的股骨骨密度,而且实验中剂量组作用优于牡蛎碳酸钙组。

　　5.2益肾填精、补钙壮骨中药复方对骨形成蛋白-4及其信号转导因子Smad5、6基因表达的影响BMP-4属于BMPs家族成员,主要存在于大鼠、兔、牛、猴等动物及人的骨基质、牙本质基质中,其作用无种属特异性[2],在诱导前体细胞向骨-软骨细胞分化方面发挥重要作用,在体内诱导骨和软骨形成,不仅促进胚胎期骨及牙组织生长发育,而且参与骨修复过程,是其他骨局部生长因子发挥生物学效应的必需因子。

BMP在诱导成骨过程中仅是一个必要条件,而不是充分条件[3]。

在BMPs诱导骨形成过程中,BMP-Smad信号转导通路是最主要的信号通路。

Smads作为已知的细胞质内BMPs信号转导因子,可以将BMP-4信号直接由细胞膜转导入细胞核内。

迄今为止,至少有9个Smads基因在蟾蜍、小鼠及人类中发现。

根据其结构和功能可以把Smad蛋白分成3类：

一是受体激活型Smads蛋白（R-Smads）,其中Smad1、5、8参与BMP信号转导,而Smad5和Smad1高度同源。

二是通用型Smad蛋白（Co-Smads）,主要是Smad4,它是TGF-β和BMP信号转导共同需要的介质[4-6]。

三是抑制型Smads蛋白（I-Smads）,其中Smad6优先抑制BMP信号转导,Smad7抑制TGF-β和BMP信号转导[7-9]。

BMP-4信号转导始于BMPs结合细胞表面的BMPI型、Ⅱ型受体,它首先与Ⅱ型受体结合,然后经Ⅱ型受体磷酸化Ⅰ型受体高度保守的GS区[10],后者活化使相应的下游信号Smad5的C末端磷酸化,活化的Smad5分子又与Smad4结合成异源复合物,转运到核内,完成BMP4信号由胞浆至胞核的转导,进而与特异的启动基元CBFAl结合,再作用于下游因子（如Osx）,影响一些特定的靶基因转录,从而诱导BMPs信号的转录应答[11]。

CBFAl在无Smad5情况下,无法独自诱导成骨细胞分化[12]。

BMP-4等刺激细胞后,Smad6mRNA转录也被诱导。

Smad6不能被受体磷酸化,但能与活化的BMPsⅠ型受体牢固结合,而不象R-Smads那样迅速从受体上脱离[10]。

因此,它能与R-Smads竞争BMPs的Ⅰ型受体,从而抑制R-Smads的磷酸化,或抑制R-Smads与Co-Smads形成异聚体,从而对BMPs信号传递起负调控作用。

综上所述,Smad5、6在BMP-4诱导成骨的信号传导中起重要作用[13]。

　　本实验所用中药复方是以鹿茸为君药,并辅以富含钙、又能“补肾中正气”（《海药本草》）的牡蛎,其功效为益肾填精、补钙壮骨。

研究发现,中药复方组均能提高BMP-4、Smad5基因表达,促进骨形成；降低Smad6基因表达,抑制骨形成的负调控机制。

这可能是益肾填精、补钙壮骨中药复方防治骨质疏松症的重要机制之一。

尤其是实验中剂量组对BMP-4诱导成骨信号转导机制的调控作用大于补钙的牡蛎碳酸钙片和补肾的骨疏康颗粒剂,可见,益肾填精、补钙壮骨中药防治骨质疏松症作用优于单纯补钙和单纯补肾,它可能通过多靶点、多途径来影响其相关基因表达,进而调节骨形成与骨吸收代谢,使其恢复偶联平衡状态,从而达到防治骨质疏松症的目的。

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