实验室指标测定方法.docx
《实验室指标测定方法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验室指标测定方法.docx（37页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
实验室指标测定方法
实验常规指标测定及实验仪器的使用
采后生理实验室
1、Vc（mg/100g）采用碘量法测定1
2、可滴定酸（%）参考国标（GB/T12456—90）——NaOH滴定法3
3、可溶性固形物（%）5
4、呼吸强度（mgCO2·Kg-1·FW·h-1）的测定6
5、乙烯生成速率（µL·Kg-1·h-1）7
6、氧气生成速率测定8
7、叶绿素含量测定10
8、果实硬度（kg·cm-2）11
9、细胞膜相对透性：
电导仪法测定12
10、乙醇、乙醛含量测定13
11、丙二醛（MDA）硫代巴比妥酸比色法14
12、多酚氧化酶（PPO）15
13、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定16
14、过氧化物酶活性（POD）测定17
15、多酚类物质18
16、总酚含量的测定19
17、超氧化物歧化酶（SOD）测定20
18、聚半乳糖醛酸梅活性的测定22
19、果胶甲酯酶（PE）活性：
酸碱滴定法-朱广廉24
20、过氧化氢酶（CAT）活性的测定25
21、GSH的测定26
22、PAL活性测定27
23、1－氨基环丙烷—1－羧酸含量（ACCcontent）的测定：
28
24、ACC合成酶活性（ACCsynthaseactivity）测定：
29
25、ACC氧化酶活性（ACCoxidaseactivity）的测定:
30
26、游离脯氨酸含量的测定-----磺基水杨酸法书180页31
27、脂氧合酶活性（△OD234/gFW·min）:
33
28、乙醇酸氧化酶活性的测定34
29、果胶含量（中国农牧渔业部部标准果胶的测定NY82.11-1988）36
30、PE38
31、PG（植物生理学实验手册-144）39
32、纤维素测定方法—————酸性洗涤法40
33、霉变指数41
34、带菌率42
35、褐变度43
36、病害体积（PVD）：
44
37、果皮颜色的测定45
38、显微镜操作46
39、色差计使用方法47
1、Vc（mg/100g）采用碘量法测定
仪器：
三角瓶；容量瓶；滴定管；移液管；脱脂棉；漏斗
试剂：
1%淀粉：
取1g可湿性淀粉，先用10ml蒸馏水调匀，然后加90ml蒸馏水煮沸，边煮边搅拌，使其透明为止。
1%草酸：
取草酸10g，用蒸馏水定容至1000ml备用。
0.01mol/L碘液的配制与标定：
配制：
取碘化钾（化学纯）3g，置于1000ml容量瓶中，少量蒸馏水溶解后，加入碘（化学纯）2.5g，振荡溶解后用蒸馏水定容至1000ml。
（注：
用时需适当稀释，以便于读数。
）
标定：
取抗坏血酸（化学纯）0.02g（20mg）置于250ml容量瓶，用1%草酸溶液定容，吸取10ml抗坏血酸标准液，置于100ml三角瓶中，加1%淀粉1ml，再加1%草酸20ml，用标准碘液滴定至蓝色，同时吸取10ml蒸馏水按同样方法做空白滴定，15s不褪色为止。
按公式计算碘液的滴定度：
H（mg/ml）=（W×P/Q）/（V1－V2）
式中：
H—每毫升碘液相当于抗坏血酸的毫克数mg/ml;
W—抗坏血酸的重量mg;
P—用来滴定得抗坏血酸得毫升数ml;
Q—抗坏血酸用草酸定容的毫升数ml；
V1—滴定时消耗碘液的毫升数ml;
V2—空白滴定时消耗碘液的毫升数ml。
方法：
称取匀浆15g，移入100ml容量瓶中，用1%草酸定容至刻度，用脱脂棉过滤。
吸取10ml滤液，置于100ml三角瓶中，加1%淀粉1ml，再加1%草酸20ml，用标准碘液滴定至蓝色，15s不褪色为止，记下消耗碘液的毫升数。
每个样品重复滴定3次，取其平均值，并做空白实验。
X=
H×（V1－V2）×F
×100
m
式中：
X—每100g样品中Vc的mg数，mg/100g；
H—碘液的滴定度，mg/mL；
V1—滴定时消耗碘液的毫升数mL；
V2—空白滴定时消耗碘液的毫升数mL；
F—试液的稀释倍数；
m—试样质量，g。
注明：
芦笋试验中：
称5g匀浆，用草酸定容到50mL，吸取10mL滤液，加淀粉1mL，20mL草酸。
黄瓜（油菜、西芹等）：
取匀浆20g,用草酸定容到100mL，吸取30mL滤液，加淀粉指示剂1mL，20mL草酸。
樱桃：
取15g,用草酸定容到100mL，吸取20mL滤液，加淀粉1mL，20mL草酸。
葡萄：
枣：
2、可滴定酸（%）参考国标（GB/T12456—90）——NaOH滴定法
试剂：
0.1mol/LNaOH溶液：
称取NaOH4g，溶于1000ml煮沸并冷却的蒸馏水（用时适当稀释）
1%酚酞指示剂：
称取1g酚酞，溶于100ml95%的乙醇中
仪器：
碱式滴定管（25ml）；容量瓶（250ml）；移液管（20ml）；三角瓶（100ml）；漏斗；纱布
组织捣碎机；分析天平
操作步骤：
称取打成匀浆的均匀样品20g，用漏斗转入250ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，放置30min（摇动2-3次），混合均匀后，用六层纱布过滤。
吸取20ml滤液与三角瓶中，加酚酞指示剂2滴，用0.005mol/LNaOH溶液滴至粉红色，持续1分钟不褪色，记下NaOH溶液用量。
每个样品重复滴定3次，取其平均值。
结果处理：
含酸量X（%）=
V×N×K×（250÷20）
×100
=
83.75×V×N
W
W
式中：
X—以苹果酸计的总算百分含量（%）；
V—滴定时消耗NaOH溶液的毫升数；
N—NaOH溶液浓度（mol/L）；
W—样品鲜重（g）；
K—换算系数，取0.067（以苹果酸计）
注意：
1、有些果蔬容易榨汁，而其汁液含酸量能代表果蔬含酸量，可以榨汁取定量汁液（10ml）稀释后（加蒸馏水20ml），直接用0.1mol氢氧化钠溶液滴定。
2、本实验配制溶液用水及稀释定容用水均为去二氧化碳的蒸馏水
3、各种有机酸当量值：
苹果酸0.067；柠檬酸0.064；酒石酸0.065。
因食品中含有多种有机酸,总酸度测定结果通常以样品中含量最多的那种酸表示。
一般分析葡萄及其制品时，用酒石酸表示，其K=0.075；分析柑橘类果实及其制品时，用柠檬酸表示，K=0.064或0.070（带一分子水），分析苹果，核果类果实及其制品时，用苹果酸表示，K=0.067，分析乳品，肉类，水产品及其制品时，用乳酸表示，K=0.090，分析酒类，调味品时，用乙酸表示，K=0.060。
4、0.1mol/LNaOH标准溶液：
称取氢氧化钠（AR）120g于250ml烧杯中，加入蒸馏水100ml，振摇使其溶解，冷却后置于聚乙塑料瓶中，密封，放置数日澄清后，取上清液5.6ml加新煮沸过并已冷却的蒸馏水至1000ml，摇匀。
标定：
精密称取0.6g（准确至0.0001g）在105～110℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾,加50ml新煮沸过的冷蒸馏水,振摇使其溶解,加二滴酚酞指示剂,用配制的NaOH标准溶液滴定至溶液呈微红色30秒不褪.同时做空白实验.计算：
c=
m×1000
（V1-V2）×204.2
式中：
c—氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，mol/L；
m—基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g；
V1—标定时所耗用氢氧化钠标准溶液的体积,，mL；
V2—空白实验中所耗用氢氧化钠标准溶液的体积，mL;
204.2—邻苯二甲酸氢钾的摩尔含量，g/mol。
5、原理：
食品中的有机弱酸在用标准碱液滴定时，被中和生成盐类。
用酚酞作指示剂，当滴定至终点（PH=8.2，指示剂显红色）时，根据耗用标准碱液的体积，可计算出样品中总酸含量。
注明：
芦笋试验中：
取10g匀浆，加50mL蒸馏水，滤纸过滤，取20mL滤液，加入2滴酚酞指示剂，用0.05mol/LnaOH滴定至粉红色。
黄瓜（油菜、西芹等）：
樱桃：
取10g匀浆，用蒸馏水定容到100mL的容量瓶，脱脂棉过滤，吸取滤液20mL，加3滴石蕊，每个样品重复3次（NaOH浓度0.05mol/L）
葡萄：
枣：
3、可溶性固形物（%）
仪器：
洗瓶；大烧杯；脱脂棉；镊子
方法：
采用pocketrefractometerPAL-1测定，每次取4个果，单果重复4次用镊子取汁测定。
4、呼吸强度（mgCO2·Kg-1·FW·h-1）的测定
方法1：
呼吸强度采用GXH-3051型便携式红外线分析测定仪测定；
方法2：
用气相色谱法测定。
取大小一致鸭梨果实9个，分别称重后，分三组置于经空气平衡的8L玻璃真空干燥器中，密闭30min，用10ml注射器从干燥器顶部取出部分气体，再从注射器中取1ml气体，用气相色谱测定，根据制作的CO2标准曲线计算果实呼吸释放出的CO2含量，果实呼吸强度以mLCO2·kg-1·h-1表示，重复3次。
气相色谱（GC7890F，上海天美公司）配置有CO2转化炉、氢火焰检测器（FID）和不锈钢填充柱（Porapak80-100），柱长2m，载气N2，进样温度120oC，柱温60℃，检测温度360℃。
呼吸强度（mlCO2·Kg-1·h-1）=
测得的CO2含量×（玻璃罐体积-果实体积）
果实总重量×密闭时间
5、乙烯生成速率（µL·Kg-1·h-1）
采用岛津2010型气相色谱仪法测定；
每次将5个葡萄果实置于350ml干燥瓶内，密闭4h后取样20ml，用岛津2010气相色谱仪程序升温法测定乙烯含量。
采用外标法计算，标样的体积分数为50μL·L-1
色谱柱与条件：
Agilent，DB-5（长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm）；检测器：
FID，温度230℃；进样口：
温度120oC；升温程序：
80℃保持2min，6℃/min升温至230℃，保持1min。
载气：
N2，流速24ml/min；尾吹气：
N2，流速30ml/min。
尾吹：
30ml/min。
乙烯的体积分数（μL·L-1）＝
样品峰面积×标样的体积分数
标样峰面积
乙烯的生成速率（µL·Kg-1·h-1）=
乙烯的体积分数×（玻璃罐体积－果实体积）
（密封时间×样品质量）
6、氧气生成速率测定
仪器：
①分光光度计；②离心机；③恒温水浴或恒温箱；④真空泵。
药品：
150nmol/L磷酸缓冲液pH7.8：
取A液（3.12gNaH2PO4·2H2O配成100ml）8.5ml，B液（7.17gNa2HPO4·12H2O配成100ml）91.5ml混合后定容至400ml即可；
2②10mmol/L盐酸羟胺：
称取6.9mgNH2OH·HCL用磷酸缓冲液pH7.8配成100ml（现用现配）；
3③17mmol·L－1对氨基苯磺酸：
称取0.2944g对氨基苯磺酸，用30%乙酸微加热溶解后定容成100ml；
4④100μmol·L－1亚硝酸钠：
取6.9mg亚硝酸钠用蒸馏水配制成100ml。
（1）NO2－标准曲线的制作：
取7支试管，按表1加入各试剂用量，加完试剂摇匀，10分钟后测A530，以1号试管溶液调零。
以NO2－浓度能够为横坐标，A530值为纵坐标绘制标准曲线。
见表：
试管号
1
2
3
4
5
6
7
亚硝酸钠
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
磷酸缓冲液
2
1.9
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
对氨基苯磺酸
1
1
1
1
1
1
1
α—萘胺
1
1
1
1
1
1
1
NO2浓度（nmol/ml）
0
2-5
5
10
15
20
25
（2）样品测定：
①NO2-培育：
取试材样1g，放入10ml试管中并加入5ml10mmol·L-1盐酸羟胺，真空渗入后，将试管置于30℃温箱中温育45分钟，以使样品体内产生的O2·-与NH2OH·HCL充分反应，生成NO2-。
②显色测定：
样品温育结束后，从样品试管中吸取2ml溶液，与1ml对氨基苯磺酸和1mlα-萘胺充分混合，约10分钟完成显色反应，显色后的混合液，如有混浊可在2500×g条件下离心10分钟，取上清液测A530。
以50mmol·L-1磷酸缓冲液2mlPH7.7,对氨基苯磺酸1ml,α-萘胺1ml混合后调零。
（3）结果计算：
测得样品A530值后，在标准曲线上查出相应的NO2浓度，然后进行O2计算。
O2·-产生速率（O2·-nmol/min·gFw）=
O2·-产生量
NH2OH育温时间（min）×样品重（g）
=
[NO2-]×2×4×V/a
min×gFw
式中：
4为反应体系毫升数
V：
为样品提取液总量（ml）
a：
为测定用样品提取液量（ml）
7、叶绿素含量测定
（1）材料：
新鲜（或烘干）的植物叶片
（2）仪器设备：
分光光度计；研钵2套；剪刀；玻棒；25ml棕色容量瓶3个；小漏斗3个；直径7cm定量滤纸；吸水纸；擦境纸；滴管；电子顶载天平（1/100g感量）。
（3）试剂：
95%乙醇（或80%丙酮）；石英砂；碳酸钙粉
（4）实验步骤：
1）．取新鲜植物叶片（或其他绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2）．称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95%乙醇（或80%丙酮）研成匀浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白，静置3～5min。
3）．取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
4）．用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。
直至滤纸和残渣中无绿色为止。
最后用乙醇定容至25ml，摇匀。
5）．把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。
以96%乙醇为空白，在波长665nm、649nm和470nm下测定光密度。
6）、如用95%乙醇计算公式：
Ca=13.95D665–6.88D649
Cb=24.96D649–7.32D665
Cx·c=（1000D470–2.05Ca–114.8Cb）/245
如用80%丙酮计算公式：
Ca=12.21D663–2.81D646
Cb=20.13D646–5.03D663
Cx·c=（1000D470–3.27Ca–104Cb）/229
式中：
Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度；Cx·C为类胡萝卜素的总浓度；D663、D646和D470分别为叶绿体色素提取液在波长663nm、646nm和470nm下的光密度，叶绿素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，类胡萝卜素为470nm。
7）．求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量（用mg/g鲜重或干重表示）：
色素的浓度X提取液体积X稀释倍数
叶绿体色素含量=-------------------------------------------------------------（mg/g）
样品鲜重（或干重）
注明：
芦笋试验中：
称1g匀浆，加20mL95%乙醇，滤纸过滤在波长665nm,649nm,470nm下测定吸光值。
樱桃：
葡萄：
枣：
8、果实硬度（kg·cm-2）
仪器：
去皮器
方法：
采用英国产TA.XT.Plus物性测定仪测定，每次取4个果在胴部去皮测定，单果重复4次取最大力，最后取其平均值；测试深度为10mm，P/2柱头（2mmØ），测试速度为2mm/sec。
（1）双击TextureExponent32
（2）关闭NotRegosterel
（3）Selectauser点OK
（4）进入TEE32界面，进入过程中，将其他所有窗都关闭
（5）点File选择New，双击Graph，最大化该窗口
（6）点TA
（7）将所测物品在载物台上放好
（8）点QuickTestRun
（9）点Library选ReturntoStartSeQ
（10）点Updataproject
（11）点File选SAVE
9、细胞膜相对透性：
电导仪法测定
用DDS-A型电导仪上海雷磁仪器厂生产测定,采用1cm直径的打孔器在5个果实赤道线上,去皮后即刻切取1mm厚薄片15个,置小烧杯中,加30mL去离子水,立即测其电导率P0,10min后测其电导率P1,然后煮沸5min,冷却至室温,并加水至刻度,测其电导率P2膜相对透性=P1-P0/P2-P0×100%膜相对透性测定重复3次,取其平均值.硬果率以每次测定时果肉硬度大于3.0Kg·cm-2的果实数目占最初总果实数目的百分比表示.。
（1）果皮相对电导率：
电导仪法测定
仪器：
小烧杯；三角瓶；洗瓶；纱布；电炉
方法：
用DDS-11A型电导仪测定，取大小一致的果皮20片（做2个重复），蒸馏水冲洗2次用干净纱布吸干水分置三角瓶中，加30mL蒸馏水，在振荡器上30℃振荡1h后测其电导率P1，然后倒入烧杯中煮沸10min以杀死植物组织，冷却至室温加水至刻度并在室温下平衡10min，测其电导率P2，重复3次，取其平均值。
膜相对电导率=P1-P0/P2-P0
P0—空白电导率℃（蒸馏水的电导率）
（2）果肉相对电导率：
电导仪法测定
仪器：
小烧杯；三角瓶；洗瓶；纱布；电炉
方法：
用DDS-11A型电导仪测定，取大小一致的果肉20片（做2个重复），蒸馏水冲洗2次用干净纱布吸干水分置三角瓶中，加30mL蒸馏水，在振荡器上30℃振荡1h后测其电导率P1，然后倒入烧杯中煮沸10min以杀死植物组织，冷却至室温加水至刻度并在室温下平衡10min，测其电导率P2，重复3次，取其平均值。
膜相对电导率=P1-P0/P2-P0
P0—空白电导率℃
10、乙醇、乙醛含量测定
取20粒葡萄，去皮去核后打浆后，称取20g匀浆样品，用200ml蒸馏水转入烧瓶中，用电热套加热蒸馏出100ml混合液。
气相色谱条件：
（岛津2010型）配置FID检测器和毛细管玻璃柱（DB-WAX）。
载气N2，流速14ml/min，进样量为1μl。
柱温100℃，气化室温度150℃，检测器温度100℃。
11、丙二醛（MDA）硫代巴比妥酸比色法
作者：
郝再彬等，《植物生理实验》哈尔滨工业大学出版社，哈尔滨，2004，9。
试剂：
0.6%硫代巴比妥酸（TBA）:
称0.6g硫代巴比妥酸用100ml10%三氯乙酸溶液定容或用热的蒸馏水溶解后定容（现配现用）。
10%三氯乙酸（TCA）：
10gTCA用水定容至100ml。
方法：
称取试样5g，加10ml质量分数为10%三氯乙酸溶液，研磨至匀浆，10000r/min下离心20min；取上清液2ml（对照加3ml10%TCA溶液），加入2ml质量分数为0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，混匀后沸水浴上反应30min，迅速冷却后再离心（如澄清可以不离心）。
取上清液测定450、532、600nm波长下的吸光度。
计算：
按下式计算MDA的含量（%）：
c1＝11.71A450
c2＝6.45（A532﹣A600）﹣0.56A450
式中：
c1—可溶性糖的浓度，mmol·L-1
c2—MDA浓度，μmol·L-1
A450、A532、A600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。
按下式算出MDA的浓度（μmol·g-1）：
MDA质量摩尔浓度（μmol·g-1）＝c·N·W-1
式中：
c—MDA的浓度，μmol·L-1；
N—提取液体积，ml；
W—植物组织鲜重，g
12、多酚氧化酶（PPO）
方法一：
1）0.05mol/LpH6.5磷酸缓冲液
2）0.1mol/L儿茶酚（邻二甲苯）：
称取1.101g溶于100ml蒸馏水中
酶液提取：
5g样品于预冷的研钵中，加入适量0.05mol/LPH6.5的磷酸缓冲液（总用量10ml），冰浴研磨成匀浆，4℃10000g离心20分钟，上清夜即为酶提取液。
活性测定：
（做两组重复实验）3.9ml0.05mol/LPH6.5的磷酸缓冲液+1ml0.1mol/L儿茶酚+2ml酶提取液，以煮过失活的酶液为对照。
37℃水浴保温10分钟，立即在420nm下测定吸光度值,30秒读一次，记录5min内得值。
计算：
酶活力=
△A×D
0.01×t
酶的比活力（0.01△A﹒g-1FW﹒min-1）=
△A×D
0.01×t×W
式中：
△A—反应时间内吸光度的变化
D—稀释倍数即提取的总酶液为反应系统内酶液体积的倍数
t—反应时间（min）
W—果肉重（g）
方法二：
比色法[21,22,23]
酶液提取：
取5g果肉，于10ml的0.05mol/l磷酸缓冲液中（pH=6.5），冰浴研磨，在4℃下10000r/min进行冷冻离心20min，取上清液进行酶活测定。
酶活测定方法：
参照Galeazzi（1981）的方法，并加以改进：
向试管中加入3.9ml0.05mol/lpH=6.5磷酸缓冲液，加2ml粗酶提取液，对照用煮沸5min的酶液，于37℃水浴中平衡10min,取出试管向其中1ml0.1mol/l的儿茶酚，立即计时，记录随后3min内溶液在420nm处的吸光度变化，每30s读数一次。
重复三次。
以每分钟变化0.1吸光度值所需酶量为一个酶活单位，用⊿A420nm·min-1·g-1·FW表示：
13、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定
参照薛应龙等人的方法进行，略有改进。
定期取果5个，去皮去核，剪碎混匀后取1g果肉于预冷的研钵中，加入0.1克聚乙烯吡咯烷酮（PVP），加入10ml含5mmol/L巯基乙醇的0.05mmol/L的0.05M硼酸缓冲液（pH8.8），冰浴研磨，10000转/分离心20分钟，上清液用于酶活测定。
取上清液1mL酶液，加入2ml的0.1M硼酸缓冲液（pH8.8）,0.02ML-苯丙氨酸1mL，混匀后立即用分光光度计测OD290初始值，38℃水浴30min后测定终止值。
重复三次。
14、过氧化物酶活性（POD）测定
样品提取与PPO同，测定参照蒋跃明[152]的方法（1997）。
反应体系：
2.9mL磷酸缓冲液，1mL愈创木酚和2mL酶液，以煮过失活的酶液为对照，加入酶液后，立即于37℃水浴中保温10min，取出试管向其中1ml2%的H2O2，于470nm波长下比色，30秒读一次，记录5min内得值。
重复三次。
酶比活力（0.01ΔA/gFW•min）=
ΔA
0.01w×t×D
15、多酚类物质
1）酒石酸铁溶液的配制：
取0.1gFeSO4.7H2O，含有4个结晶水的酒石酸钾钠0.5g，加蒸馏水溶解定容到100ml。
2）酶液提取：
取20g果肉，冰浴研磨，假如PH7.8磷酸缓冲液定容至100ml，沸水浴加热10min，过滤，冷却至室温，滤液为供试液。
3）比色测定：
5ml供试液，加5ml磷酸缓冲液，加5ml酒石酸铁溶液，充分摇匀后立即测定OD540nm，空白：
蒸馏水5ml
多酚%（以茶多酚计）=
A×7.826×V1×100
1000×V2×m
式中：
V1---------供试液总量
V2---------供试液吸取量
m-----------样品质量
16、总酚含量的测定
（1）药品：
75％甲醇
升级会员 