实验微生物接种技术讲解.docx

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实验微生物接种技术讲解

实验微生物接种技术讲解

实验微生物接种技术讲解

　　语：

为你精心的微生物接种,希望对你有帮助!

如果喜欢就我们（）的后续更新吧！

　　学习微生物工作的根本接种方法，建立纯培养技术中的“无菌”概念，掌握无菌操作技术。

　　所谓接种就是将一定量的纯种微生物在无菌操作条件下转移到另一已灭菌，并适宜于该菌生长繁殖所需的培养基上的过程。

本实验要求严格进行无菌操作，一般是在无菌操作台或在实验室内火焰旁进行。

根据不同的实验目的和培养方式，可以采用不同的接种工具和接种方法。

　　斜面培养基、液体培养基、平板培养基、记号笔、酒精灯、接种针、消毒酒精、涂布棒等。

　　菌种别离或移接工作应在无菌环境中进行，接种室、接种箱或超净工作台是常用的接种环境。

用前先清洁好卫生，再进行消毒处理。

可用紫外线灯和甲醛熏蒸的双重作用，或用3%来苏尔及其他外表消毒进行喷雾。

　　操的手应先用肥皂洗净，再用酒精棉球消毒；整个操作过程都要靠近酒精灯火焰；接种工具在用前和用后必须在灯焰上灭菌；棉塞不得乱放，操作中只能夹在手上；不能有跑、跳等力度大的动作，以免引起空气大振动而增加染菌时机。

　　从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的方法。

此法用于好气性微生物的接种。

　　左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。

用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，用右手的小指、无名指和手掌拨下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上燃烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入管内，冷却、挑菌，立即转入斜面管底部，沿斜面划曲线或直线。

　　图1.斜面接种示意图

　　由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。

　　操作与上法根本一致，只是在将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。

如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。

　　用接种针挑取菌种后，插入深层固体培养基内，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。

　　将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、别离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：

　　1）斜面接平板

　　a.划线法：

见平板划线别离法。

　　b.点种法：

一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻轻点在平板的外表（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）即可。

　　2）平板接斜面：

一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。

　　1．何谓无菌操作？

接种前应作哪些准备工作？

　　2．总结几种接种方法的要点及应注意的事项？

　　实验目的：

学习掌握无菌操作技术；学习接种方法；学习常用的别离、纯化菌种的方法。

实验内容：

　　将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。

１、接种工具和方法

　　在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。

由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。

有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。

在固体培养基外表要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。

（图３－３）

　　图３－３接种和别离工具

　　1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀

　　常用的接种方法有以下几种：

　　１）划线接种这是最常用的接种方法。

即在固体培养基外表作来回直线形的移动，就可到达接种的作用。

常用的接种工具有接种环，接种针等。

在斜面接种和平板划线中就常用此法。

２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。

此法即把少量的微生物接种在平板外表上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。

除三点外，也有一点或多点进行接种的。

　　３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。

做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。

用的培养基一般是半固体培养基。

它的做法是：

用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，那么在穿刺线周围能够生长。

　　４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°

　　C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就到达稀释的目的。

待平板凝固之后，置适宜温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。

　　５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在外表作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。

　　６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。

　　７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。

８）活体接种活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。

所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。

接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。

　　培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。

在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。

　　实验台面不管是什么材料，一律要求光滑、水平。

光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。

在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽量减少，其周围杂菌也应越少越好。

为此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。

　　空气中的杂菌在气流小的情况下，随着灰尘落下，所以接种时，翻开培养皿的时间应尽量短。

用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。

接种环的火焰灭菌方法：

通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。

（图３－４）然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。

不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。

平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖翻开一小局部进行接种。

在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。

　　含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixedculture）。

如果在一个菌落中所有细胞均于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pureculture）。

在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。

得到纯培养的过程称为别离纯化，方法有许多种。

１、倾注平板法

　　首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40~50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。

单一细胞经过屡次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。

（图３－５，a）

　　图３－５倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解1.菌悬液2.熔化的培养基3.培养物4.无菌水

　　图３－５倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解1.菌悬液2.熔化的培养基3.培养物4.无菌水

　　首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基外表上，经恒温培养便可以得到单个菌落。

（图３－５，b）３、平板划线法

　　最简单的别离微生物的方法是平板划线法。

用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。

划线的方法很多，常见的比拟容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

（图３－６）当接种环在培养基外表上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。

（图３－７）

　　在实验室中，为了别离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水0浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。

然后快速冷却，并进行接种。

接种后，参加无菌的石蜡于培养基外表，使培养基与空气隔绝。

另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。

有时为了更有效地别离某些厌氧菌，可以把所别离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。

　　微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素，如营养物浓度、温度、水分、氧气、ＰＨ等。

微生物的种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。

　　微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到外界许多因素。

影响微生物生长的因素很多，简要介绍如下。

　　细菌的生长率与营养物的浓度有关:

μ=μmax*C/（K+C）营养物浓度与生长率的关系曲线是典型的双曲线。

　　K值是细菌生长的很根本的特性常数。

它的数值很小，说明细菌所需要的营养浓度非常之低，所以在自然界中，它们到处生长。

然而营养太低时，细菌生长就会遇到困难，甚至还会死亡。

这是因为除了生长需要能量以外，细菌还需要能量来维持它的生存。

这种能量称为维持能。

另一方面，随着营养物浓度的`增加，生长率愈接近最大值。

　　在一定的温度范围内，每种微生物都有自已的生长温度三基点：

最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度。

在生长温度三基点内，微生物都能生长，但生长速率不一样。

微生物只有处于最适生长温度时，生长速度才最快，代时最短。

超过最低生长温度，微生物不会生长，温度太低，甚至会死亡。

超过最高生长温度，微生物也要停止生长，温度过高。

也会死亡。

一般情况下，每种微生物的生长温度三基点是恒定的。

但也常受其它环境条件而发生变化。

根据微生物最适生长温度的不同，可将它们分为三个类型：

a.嗜冷微生物：

其是适生长温度多数在-10℃－20℃之间b.中温微生物：

其最适生长温度一般在20℃－45℃之间c.嗜热微生物：

生长温度在45℃以上。

　　水分是微生物进行生长的必要条件。

芽孢、孢子萌发，首先需要水分。

微生物是不能脱离水而生存的。

但是微生物只能在水溶液中生长，而不能生活在纯水中。

各种微生物在不能生长发育的水分活性范围内，均具有狭小的适当的水分活性区域。

　　按照微生物对氧气的需要情况，可将它们分为以下五个类型。

a.需氧微生物

　　这类微生物需要氧气供呼吸之用。

没有氧气，便不能生长，但是高浓度的氧气对需氧微生物也是有毒的。

很多需氧微生物不能在氧气浓度大于大气中氧气浓度的条件下生长。

绝大多数微生物都属于这个类型。

b.兼性需氧微生物

　　这类微生物在有氧气存在或无氧气存在情况下，都能生长，只不过所进行的代谢途径不同罢了。

在无氧气存在的条件下，它进行发酵作用，例如酵母菌的无氧乙醇发酵。

c.微量需氧微生物

　　这类菌是需要氧气的，但只在0.2大气压下生长最好。

这可能是由一它们含有在强氧化条件下失活的酶，因而只有在低压下作用。

d.耐氧微生物

　　这类微生物在生长过程中，不需要氧气，但也不怕氧气存在，不会被氧气所杀死。

c.厌氧微生物

　　这类微生物在生长过程中，不需要分子氧。

分子氧存在对它们生长产生毒害，不是被抑制，就是被杀死。

　　好氧培养：

也称“好气培养”。

就是说这种微生物在培养时，需要有氧气参加，否那么就不能生长良好。

在实验室中，斜面培养是通过棉花塞从外界获得无菌的空气。

三角烧瓶液体培养多数是通过摇床振荡，使外界的空气源源不断地进入瓶中。

　　厌氧培养：

也称“厌气培养”。

这类微生物在培养时，不需要氧气参加。

在厌氧微生物的培养过程中，最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。

一般可采用以下几种方法：

a.降低培养基中的氧化复原电位：

常将复原剂如谷胱甘肽、硫基醋酸盐等，参加到培养基中，便可到达目的。

有的将一些动物的死的或活的组织如牛心、羊脑参加到培养基中，也可适合厌氧菌的生长。

　　b.化合去氧：

这也有很多方法，主要有：

用焦性没食子酸吸收氧气；用磷吸收氧气；用好氧菌与厌氧混合培养吸收氧气；用植物组织如发芽的种子吸收氧气；用产生氢气与氧化合的方法除氧。

　　c.隔绝阻氧：

深层液体培养；用石蜡油封存；半固体穿刺培养。

　　d.替代驱氧用二氧气碳驱代氧气；用氮气驱代氧气；用真空驱代氧气；用氢气驱代氧气；用混和气体驱代氧气。

　　固质培养：

是将菌种接至疏松而富有营养的固体培养基中，在适宜的条件下进行微生物培养的方法。

　　液体培养：

在实验中，通过液体培养可以使微生物迅速繁殖，获得大量的培养物，在一定条件下，还是微生物选择增菌的有效方法。

　　微生物接种就是在无菌条件下，用接种工具（针、环）从一支原菌种中挑取少许菌体，接入到另一支新的培养基上扩大培养的技术。

　　要想得到大量的菌种，适应生产、科研和教学要求，就要进行微生物的接种，扩大菌种数量。

接种因使用不同容器、不同的培养基，到达不同的目的，而有不同的接种方法，但它们的根本要求是相同的。

通常接种都应在空气经过消毒灭菌的接种室或接种箱或超净工作台内完成。

（1）左手夹住试管

（2）灼烧接种环

　　（3）拔出棉塞，夹在小指、无名指上，管口过火

　　（4）取菌、接种，接种后在火焰上方迅速塞好棉塞

　　（5）写好标签（菌种名、日期、接种者姓名），贴于斜面正上方前端约1cm处.

　　（6）于37度培养箱中培养24小时。

（全班统一装入一保鲜袋）

　　（7）一星期后观察别离效果，拍照，分析结果

（1）将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。

（2）右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。

　　（3）用左手的拇指和食指将培养皿翻开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10到20ml）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。

　　（4）等待平板冷却凝固。

（1）用75%酒精或0.01%新洁而灭擦洗双手,进行消毒处理。

（2）将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。

　　（3）取少量菌液滴加到培养基外表。

　　（4）将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8~10s。

　　（5）用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基外表，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。

　　（6）将接种好的平板在皿底做好标记。

　　（7）涂布别离的平板全班一起放入保鲜袋中，37度培养箱中倒置培养24h。

　　（8）一星期后以小组为单位观察别离效果，拍照，分析结果4.划线别离：

从污染平板中纯化细菌菌落（每人1个平板）

（1）用75%酒精或0.01%新洁而灭擦洗双手,进行消毒处理。

（2）将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿接种环，在火焰上灼烧，待冷却后用接种环在长有混合菌落的平板上挑取少量菌种，用左手的拇指和食指将培养皿翻开一条缝隙，划线，其他每区划线之前一定要把剩余的菌体烧掉；待接种环完全能却后通过前1区划线。

（一般划4个区）

　　（3）将接种好的平板在皿底做好标记。

　　（4）划线别离的平板全班一起放入保鲜袋中，37度培养箱中倒置培养48h.

　　（5）一星期后观察别离效果，拍照，分析结果

　　实验结果及分析：

此次斜面接种无污染，菌体生长较旺盛，形成了较多的单菌落，别离效果较好，这与接种场所进行了严格的消毒处理以及接种操作在超净工作台上进行，接种前用75%酒精对双手进行了消毒处理，接种工具、管、瓶口接种前后要通过灼烧灭菌，塞子不能脱手等因素都有关，有效地防止了杂菌的污染。

菌体的生长情况跟培养温度、湿度、pH都有关。

但接种时没有使接种面积到达最大，以至于没有最充分地利用培养基，菌体没有长满培养基，还有接种时不小心划破了培养基的外表，下次做斜面接种时要注意尽可能地使接种面积到达最大，最充分地利用培养基，还有就是要防止划破培养基，力求做到操作标准、科学、准确。

　　上图为稀释100倍的涂布平板法结果

　　上图为稀释1000倍的涂布平板法结果

　　上图为稀释10，000倍的涂布平板法结果

　　上图为稀释100，000倍的涂布平板法结果

　　实验结果与分析：

如上4幅图所示，此次所用菌液中包含两种菌，即大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌，其中菌落较大、数量较多的为苏云金芽孢杆菌，而菌落较小、数量较少的为大肠杆菌，说明混合菌液中苏云金芽孢杆菌的浓度较大。

经稀释100倍的菌液所生长起来的菌落数量最多，单菌落数量也挺多，但所占的比例不大，特别是苏云金芽孢杆菌大多数都连在了一起，别离效果不好。

经稀释1000倍的菌液所生长起来的菌落数量较多，可以看到苏云金芽孢杆菌依然连成片，有些大肠杆菌菌落生长在苏云金芽孢杆菌菌落之上，就大肠杆菌而言，单菌落较多，别离效果较稀释100倍的菌液好。

经稀释10，000倍的菌液所生长起来的菌落数量较少，依然有局部苏云金芽孢杆菌连成了片；大局部大肠杆菌菌落为单菌落，别离效果较好。

经稀释10，000倍的菌液所生长起来的菌落数量最少，但苏云金芽孢杆菌依然连成了片；虽然大肠杆菌的单菌落较少，但别离效果是四个浓度中最好的。

综上所述，在一定浓度范围内，稀释倍数越大，别离效果越好。