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酶工程实验报告一纤维素酶活力测定要点

本科学生实验报告

学号*******40姓名孙永升

学院生命科学学院专业、班级10生物技术

实验课程名称酶工程<实验>

教师及职称李俊俊<讲师>

开课学期2012至2013学年第二学期

填报时间2013年4月9日

云南师范大学教务处编印

实验名称

实验方式

小组成员

实验一、纤维素酶活力测定

小组合作

1、实验目的

1.1学习并了解纤维素酶的基本特性；

1.2学习酶活力的测定方法；

1.3学习还原糖的测定、标准曲线的制作及分光光度计的使用方法；

1.4学会对实验数据的处理及实验报告的撰写；

2、实验仪器、试剂和溶液：

A2仪器：

A2.1滤纸酶活力（FPA）的测定中仪器：

除普通实验室仪器外，还应有:

分光光度计、酸度计精度士0.01pH、恒温水浴（50士0.l）0C、分析天平感量0.1mg、磁力搅拌器、秒表或定时钟、沸7k洛（可用800W申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成）、具塞刻度试管25mL。

A2.2羧甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS）测定中仪器：

自动连续多档分配器、漩涡混合器试管、水浴等仪器同A2.1

B2试剂和溶液（除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。

）

B2.1葡萄糖标准曲线制备：

①葡萄糖标准贮备溶液（10mg/mL）：

称取于（103士2）℃下烘千至恒重的无水葡萄糖1g,精确至0.1mg，用水溶解并定容至100mL,

②葡萄糖标准使用溶液：

分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0.00,1.00,1.50,2.00,2.50,3.00,3.50mL于10mL容量瓶中，用水定容至10mL，盖塞，摇匀备用。

上述系列浓度应根据需要自行调整。

B2.2滤纸酶活力（FPA）的测定中用到的试剂和溶液：

①DNS试剂：

称取3,5一二硝基水杨酸（10士0.1）g，置于约600mL水中，逐渐加入氢氧化钠l0g，在50℃水浴中（磁力）搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200g、苯酚（重蒸）2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000mL，过滤。

贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。

②柠檬酸缓冲液，0.05mol/LpH4.8（适用于酸性纤维素酶）：

称取一水柠檬酸4.83g,溶于约750mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g,用水定容至1000mL。

调节溶液的pH到（4.8士0.05）备用。

③磷酸缓冲液，0.1mol/LpH6.0（适用于中性纤维素酶）：

分别称取一水磷酸二氢钠121.0g和二水磷酸氢二钠21.89g，将其溶解在10L去离子水中。

调节溶液的pH到（6.0士0.05）备用。

溶液在室温可保存一个月。

⑥快速定性滤纸（杭州新华一号滤纸）沪15cm（每批滤纸，使用前用标准酶加以校正）。

B2.3羧甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS）测定用到的试剂和溶液：

①竣甲基纤维素钠（CMC-Na）：

化学纯（上海光华化学试剂厂）在25℃,2%水溶液，粘度800mPa.s-1200mPa.so（每批羧甲基纤维素钠使用前用标准酶加以校正）。

②柠檬酸钠缓冲液，同上。

③磷酸缓冲液，同上。

④CMC-Na溶液：

称取2gCMC-Na,精确至1mg，缓缓加入相应的缓冲液约200mL并加热至800℃-900℃，边加热边磁力搅拌，直至CMC-Na全部溶解，冷却后用相应的缓冲液稀释至300mL，用2mol/L盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH到（4.8士0.05）（酸性纤维素酶）或（6.0士0.05）（中性纤维素酶），最后定容到300mL,搅拌均匀，贮存于冰箱中备用。

⑤DNS试剂同上。

3、实验原理及实验流程或装置示意图：

A3滤纸酶活力（FPA）的测定原理:

纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物（滤纸）水解，释放出还原糖。

在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖（以葡萄糖计）含量成正比。

通过在540nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的滤纸酶活力。

以此代表纤维素酶的酶活力。

B3羧甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS）测定原理：

纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物（狡甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。

在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖（以葡萄糖计）含量成正比。

通过在540nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的CMCA-DNS酶活力。

以此代表纤维素酶的酶活力。

C3实验流程:

葡萄糖标准曲线制作

滤纸酶活力（FPA）的测定

羧甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS）测定

D3酶活定义

D3.1纤维素酶：

在各种酶组分的协同作用下，能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖的酶。

D3.2滤纸酶活力Filterpaperactivity（FPA）

lg固体酶（或1mL液体酶），在（50士0.1）℃,指定pH条件下（酸性纤维素酶pH4.8，中性纤维素酶pH6.0）,lh水解滤纸底物，产生出相当于lmg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g（或u/mL）表示。

D3.3羧甲基纤维素酶活力（CMCA）

D3.3.1还原糖法lg固体酶（或1mL液体酶），在（50士0.1）℃、指定pH条件下（酸性纤维素酶pH4.8,中性纤维素酶pH6.0）,lh水解羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g（或u/mL）表示。

简写为CMCA-DNS。

D3.3.2粘度法1g固体酶（或1mL液体酶），在（40士0.1）℃、指定pH条件下（酸性纤维素酶pH6.0，中性纤维素酶pH7.5），水解羧甲基纤维素钠底物，使底物粘度降低而得到的相对于标准品的纤维素酶相对酶活力。

简写为CMCA-VIS。

4、实验方法步骤、操作流程及注意事项：

A4葡萄糖标准曲线制备流程：

A4.1绘制标准曲线的方法

A4.1.1先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。

A4.1.2浓度c为横坐标，OD为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。

A4.1.3然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。

A4.1.40.1%葡萄糖标准曲线的制作流程：

如表一：

取7支试管，编号，按照下表进行操作：

如表一所示

试管编号

葡萄糖溶液体积（ml）

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

葡萄糖含量（mg）

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

缓冲液（ml）

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

DNS（ml）

定容总体积（ml）

OD（540nm）

（葡萄糖标准贮备溶液的浓度为1mg/ml。

）

表一

B4滤纸酶活力（FPA）的测定步骤:

B4.1待测酶液的制备：

称取同体酶样1g,精确至0.1mg（或吸取液体酶样1mL，精确至0.01mL），用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内），放置10min，待测。

（本实验中已提前稀释到200倍。

）

B4.2滤纸条的准备：

①将待用滤纸放入（硅胶）干燥器中平衡24h:

②将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为（50士05）mg的滤纸条，折成M型备用。

B4.3操作步骤:

①取三支25mL刻度具塞试管（一支空白管，二支样品管）。

实验中分为两组：

4.8与pH6.0。

pH4.8酶液稀释到1000倍，pH6.0酶液稀释到5000倍。

②将折成M型的滤纸条，分别放入每支试管的底部〔沿lcm方向竖直放入）。

③分别向四支管中，准确加入相应pH的缓冲溶液1.50mL。

④分别准确加入稀释好的待测酶液0.50mL于三支样品管中（空白管不加），使管内溶液浸没滤纸，盖塞。

⑤将三支试管同时置于（50士0.1）℃水浴中，准确计时，反应60min，取出。

⑥立即准确地向各管中加入DNS试剂3.0mL。

再于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.50mL,摇匀。

将四支管同时放入沸水浴中，加热10min,取出，迅速冷却至室温，加水定容至25mL,摇匀。

⑦以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，分别测量二支平行管中样液的吸光度。

取平均值。

以吸光度平均值查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。

C4羧甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS）测定操作步骤：

C4.1待测酶液的稀释：

实验前已将酶液稀释到10000倍。

C4.2操作步骤:

①取三支25mL刻度具塞试管（一支空白管，三支样品管）。

实验中分为两组：

4.8与pH6.0。

pH4.8酶液稀释到1000倍，pH6.0酶液稀释到5000倍。

②分别向四支管中，准确加入用相应pH缓冲溶液配制的CMC-Na溶2.00mL。

③分别准确加入稀释好的待测酶液0.50mL于三支样品管中（空白管不加），用漩涡混匀器混匀，盖塞。

④将四支试管同时置于（50+0.1）℃水浴中，准确计时，反应30min，取出。

⑤迅速、准确地向各管中加入DNS试剂3.0mL，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.50mL,摇匀。

将四支管同时放入沸水浴中，准确计时，加热10min，取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL。

⑥以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，分别测量三支样品管中样液的吸光度，取平均值。

通过查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。

D4.3滤纸酶活力（FPA）的测定步操作流程：

如表二所示：

操作步骤

空白管

样品管A

样品管B

步骤1

试管底部放入折好的M型滤纸条

步骤1

加入相应pH的缓冲液1.5mL（实验中两个pH梯度pH6.0与pH4.8）

步骤2

稀释酶液至所需测定倍数（原酶液为200倍pH4.8为1000；pH6.0为5000）

步骤3

——

加入待测酶液0.5mL

步骤4

50℃精确保温60min

步骤5

加入3mLDNS试剂终止反应

步骤6

混合均匀

步骤7

加入0.5mL待测酶液，

沸水浴煮沸10min

步骤8

流水冷却至室温

步骤9

加蒸馏水定容至25mL，混匀

步骤10

OD540nm比色

（注意：

OD=（A+B）/2，比色前根据具体情况稀释相应的倍数。

）

表二

D4.4羧甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS）测定操作流程:

如表三所示：

操作步骤

空白管

样品管A

样品管B

步骤1

加入相应pH的缓冲液配制的2mLCMC-Na（实验中两个pH梯度pH6.0与pH4.8）

步骤2

稀释酶液至所需测定倍数（原酶液为200倍pH4.8为1000；pH6.0为5000）

步骤3

——

加入待测酶液0.5mL（漩涡混匀）

步骤4

50℃精确保温30min

步骤5

加入3mLDNS试剂终止反应

步骤6

加入0.5mL待测酶液

混合均匀

——

步骤7

沸水浴煮沸10min

步骤8

流水冷却至室温

步骤9

加蒸馏水定容至25mL，混匀

步骤10

OD540nm比色

（注意：

OD=（A+B）/2，比色前根据具体情况稀释相应的倍数。

）

表三

E4.5酶活测定注意事项

试管上编号：

贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；

移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。

精确记时：

每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；

避免试管进水：

煮沸和用流水冲洗时；

5实验处理

A5实验现象、数据及观察结果

A5.1标准曲线的测量结果：

如表四：

试管编号

OD（540nm）值

—

0.0595

0.2135

0.345

0.493

0.622

表四

A5.2滤纸酶活力（FPA）的测定测定纤维素酶活现象及结果：

A5.2.1酸性纤维素酶pH4.8：

如表五

试管号

颜色

空白管

样品管A

样品管B

浅黄色

棕黄色

OD540nm

0.00

0.080

0.070

表五

A5.2.2中性纤维素酶pH6.0：

如表六

试管号

颜色

空白管

样品管A

样品管B

浅黄色

棕黄色

OD540nm

0.00

0.054

0.052

如表六

B5.3羧甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS）测定现象及结果：

B5.3.1酸性纤维素酶pH4.8：

如表七

试管号

颜色

空白管

样品管A

样品管B

浅黄色

棕黄色

OD540nm

0.00

0.054

0.052

表七

B5.3.2中性纤维素酶pH6.0：

如表八

试管号

颜色

空白管

样品管A

样品管B

浅黄色

棕黄色

OD540nm

0.00

0.080

0.070

如表八

B5实验结果处理：

B5.1葡萄糖标准曲线如图1：

图1标准曲线

葡萄糖标准曲线如上图所示，得回归直线方程y=kx-0.0747，k=0.7023，R2=0.9992>0.99，该标准曲线相关性很好。

式中Y表示表示测定的吸光度（OD）值，X表示还原糖的浓度,0.0747表示补偿参数。

B5.2纤维素酶活计算结果：

纤维素酶活国际单位：

在特定条件（25℃，具最适底物浓度、最适温度、最适pH和离子强度系统）下，每分钟内转化1umol底物或催化1umol产物形成所需要的酶量为1个酶活单位。

单位u/mL

B5.3滤纸酶活力Filterpaperactivity（FPA）指：

计算公式：

滤纸酶活力X1=（OD平均值+b）/0.5×n（b为截距，N酶液稀释倍数）

国际单位酶活X=X1×100/（180.2×60）×1000U/mg

B5.3.1：

酸性纤维素酶pH4.8

滤纸酶活力：

X1=（0.075+0.0747）/0.5×1000=299.4u/mL

国际单位酶活：

X=2769U/mg

B5.3.2：

中性纤维素酶pH6.0

滤纸酶活力：

X1=（0.053+0.0747）/0.5×1000=255.4u/mL

国际单位酶活：

X=2362U/mg

B5.4羧甲基纤维素酶活力（CMCA）：

（还原糖法）lg固体酶（或1mL液体酶），在（50士0.1）℃、指定pH条件下（酸性纤维素酶pH4.8,中性纤维素酶pH6.0）,lh水解羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g（或u/mL）表示。

简写为CMCA-DNS。

计算公式：

CMCA-DNS酶活力计算=Ax1/0.5xnx2

羧甲基纤维素酶活力X1=（OD平均值+b）/0.5×n×2（b为截距，N酶液稀释倍数）

国际单位酶活X=X1×100/（180.2×30）×1000U/mg

B5.4.1：

酸性纤维素酶pH4.8

CMCA-DNS酶活：

X1=（0.481+O.0747）/0.5×2×10000=22248u/mL

国际单位酶活：

X=41154U/mg

B5.4.2：

中性纤维素酶pH6.0

CMCA-DNS酶活：

X1=（0.279+O.0747）/0.5×2×10000=3537u/mL

国际单位酶活：

X=65430U/mg

C5分析与讨论：

C5.1葡萄糖标准曲线：

葡萄糖标准曲线制作得回归直线方程y=kx-0.0747，k=0.7023，R2=0.9992>0.99，该标准曲线相关性很好。

从而确定该标准曲线可用于酶的活力测定。

可做滤纸酶活力（FPA）与CMCA-DNS酶活力测定。

式中Y表示表示测定的吸光度（OD）值，X表示还原糖的浓度,0.0747表示补偿参数。

C5.2滤纸酶活力（FPA）、羧甲基纤维素酶活力：

由结果可以看出纤维素滤纸酶活、羧甲基纤维素酶在两个反应环境—酸性与中性中，纤维素滤纸酶活于pH4.8高于pH6.0，说明纤维素滤纸酶活使用中酶活环境应该是在酸性中发挥作用好，需要进一步试验验证。

底物不同，活力的测定值也不同，以羧甲基纤维素为底物测得的酶活值CMCA比以滤纸为底物测得的酶活值FPA高；这说明酶对水溶性底物有较高的活力；也表明了吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响。

从本次试验可以看出纤维素酶活反应中对pH要求一般为酸性环境、温度（50士0.1）℃。

这样能发挥出该酶的最大效率。

因此再生产实践中使用纤维素酶应保证最适pH、温度（50士0.1）℃。

当然没反应受各种因素共同作用，其活性受温度、pH、反应体系溶液的离子强度、酶浓度、底物、反应时间等各种因素综合作用都会影响酶活力的反应、测定结果，本次试验只是简单地验证性实验测定。

要更加准确测定糖化酶活需要我们减少或控制其他变量，只针对单一变量操作，这些有待进一步实验。

6、实验小结

本次实验成败之处及其原因分析：

（1）、了解了纤维酶活的两种测定方法，加强实验动手能力，小组合作意识。

（2）、熟悉了酶活力的测定方法与酶活单位的定义、意义。

（3）、由于酶的反应特殊性与复杂综合因素影响因此在酶活力测定过程中，为了减少误差，应该熟悉掌握操作过程，对影响到的诸多因素严格控制，如：

对温度严格控制，反应时间、温度严格控制，尽量减少误差，使结果可靠、准确。

另外为了减少视觉误差造成的影响，还可进行实验预滴定。

改进措施：

（1）、测酶活时严格控制影响到的因素，如反应温度、时间、pH等。

量取液体时精确，如缓冲液、酶液、DNS试剂等。

（2）、对反应后的实验结果认真仔细观察做好记录。

养成科学分析问题的习惯。

7实验思考题：

A.7酶活力测定原则是什么？

答：

酶活力测定时，应做到快速、简便、准确的原则。

（1）提供最适底物（专一性），当同时有几种底物时，以Km值最小的为最适底物。

（2）测定时，酶量要适量。

（3）确定的反应时间要适宜，时间越长，酶活越低；时间越短，酶活越高。

（4）反应条件是最适条件，主要包括反应温度、pH值和基质的离子环境。

B.7酶活力测定应注意哪些问题？

答：

测定酶活性时，最适条件的选择应该遵循最适底物浓度、最适温度、最pH值、满足辅助因子和激活剂、避免抑制剂的原则。

（1）底物浓度，由于[S]与反应速度V成双曲线关系，在酶活性测定时，要求[S]达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比。

（2）酶浓度，在反应条件一定时，酶浓度与反应速度成正比。

按照中间产物学说，只有[S]>>[E]时，酶才能被底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。

因此当标本酶活力过高时，应将标本适当稀释后再加以测定。

（3）温度，不同的酶最适温度可以不同，多数酶的最适温度在37～40℃，高于或低于最适温度，酶活性都降低，因此要求酶活性测定要在恒温条件下进行，温度波动要控制在±1℃。

（4）离子强度和pH值，在最适pH时，酶的活性最强，高于或低于最适pH，酶的活性都降低，多数酶的最适pH在5～8之间。

在测定酶活性时，要求缓冲液具有足够的缓冲容量，以便使pH值保持稳定。

（5）辅助因子，某些金属离子和维生素类辅酶是结合酶的辅助因子。

基肽酶的辅基，如果酶离开它们的辅基或辅酶就不能表现活性，因此在酶活性

测定时，就要保证辅基或辅酶的供给。

（6）激活剂，有些酶在有激活剂存在时才有活性或活性较高，例如Mg2+是肌酸激酶的激活剂，因此在酶活性测定时，也要满足酶对激活剂的需要。

（7）抑制剂，酶的抑制可分为不可逆抑制和可逆抑制，后者又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制。

抑制剂使酶活性降低，在测定酶活性时，应避免抑制剂的影响。

C.7本实验中所设置的对照管的作用？

它与比色法测定物质含量实验中设置的空白管有何异同？

本实验可否用对照管调分光光度计的100%T？

为什么？

答：

（1）消除非酶促反应（如淀粉酸性环境下加热水解）和非测定时间内的酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差。

（2）两种都是为了消除非测定部分对光的吸收，空白组是为了消除溶液中溶剂等其它组分对光的吸收，而对照管是为了消除非测量所需反应所得的多余溶质对光的吸收。

（3）不可，因为标准曲线的确定是在空白的基础上的，得到的是OD值与麦芽糖含量的关系

8参考文献：

[1]纤维素酶制剂,中华人民共和国轻工业行业标准.QB2583-2003.

[2]张瑞萍.纤维素酶的滤纸酶活和CMC酶活的测定[J].印染助剂,2002,5（19）51~53.

[3]陈守文主编.酶工程[M].北京:

科学出版社,2008,9~14.

[4]姜心,陈伟,周波等.纤维素酶活测定影响因素的研究[J].食品工业科技,2010,05（9）45~47.

指导老师评语及得分：

签名：

2013年04月日

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