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关于库仑电化学法快速测定单胺类神经递质的方法学研究
【编者按】医药论文是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果的
论说性文章。
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关于库仑电化学法快速测定单胺类神经递质的方法学研究
作者：
肖凤霞，邓少东，田青，邓超明1，周改莲
【摘要】目的建立库仑阵列电化学高效液相色谱法快速测定大鼠脑组织中的单胺
类神经递质的含量。
方法采用库仑阵列电化学检测器检测去甲肾上腺素（NE）、多巴胺
（DA）、5?
羟色胺（5?
HT）、5?
羟吲哚乙酸（5?
HIAA），采用PhenomenexC18反相色谱柱
（150mm4.60mm，5m），流动相为缓冲液?
乙腈（体积比87∶13），流速为1mLmin-1，
柱温为35℃。
结果4种单胺类神经递质的最低检测限为0.01515～0.01815ng,回收
率为85.3%～100.5%。
结论该法具有快速、准确、灵敏、样品制备简便等优点，可
用于大鼠脑组织中单胺类神经递质的分离检测。
1
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【关键词】高效液相色谱法;单胺类神经递质;库仑阵列电化学检测器
（1.SchoolofTCM,GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou
Guangdong510006,China;2.TaishanMedicalUniversity,Taian,Shandong
271016,China）Abstract:
ObjectiveToestablisharapidmethodfordeterminingmonoamine
neurotransmittersinratsbraintissuebyHPLCwithcoularraydetector.MethodsHPLCwas
performedonaPhenomenexC18column（1504.60mm,5micron）.Themobile
phase,consistedofacetonitrile?
waterphase（13∶87）,wasataflow?
rateof1mLmin-1.The
columntemperaturewaskeptat35℃.ThelevelsofNE,DA,5?
HTand5?
HIAAwere
determined.ResultsTheminimummeasurementlimitwas0.01515-0.01815ng.Theaverage
recoverieswere85.3%-100.5%.ConclusionThismethodisrapid,accurate,highlysensitive
andeasytooperate.Theprocedureissuitablefordeterminingthemonoamine
neurotransmittersinratsbraintissue.
Keywords:
HPLC;monoamineneurotransmitters;coularraydetector
单胺类物质包括去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5?
羟色胺（5?
HT）、五羟吲哚乙酸
（5?
HIAA）等物质，是哺乳动物和人类中枢神经重要的信息传递物质。
研究该类物质及
其代谢产物在体内的含量变化，对于阐明药物在体内的作用机制，提供了有力的依
据。
尤其在老年痴呆症、抑郁症、儿童多动症、儿童多动秽语综合征等疾病与神经递
2
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质含量关系、药物治疗效果等方面的研究中，可提供非常有用的信息[1]。
目前文献报
道此类物质常见的检测方法主要有高效液相色谱?
电化学检测器测定法（HPLC?
ECD）、
荧光法、放射酶学分析法等[2]。
其中以HPLC?
ECD测定法报道的较多，但现有的
HPLC?
ECD测定法存在流动相成分复杂[3]、重现性差、检测时间长、样品前处理不彻
底等问题。
本研究改进了现有的测定方法，建立起一种流动相单一、重现性好、检测
时间短、样品处理完全,并可同时测定4种单胺类物质及其代谢产物的检测方法。
1仪器与试药
1.1仪器
库仑阵列电化学高效液相色谱仪[Model5600A?
16通道检测器（美国ESA公司），
Model582solventDeliverySystem，Model542自动进样器，CoularrayWin工作站]，
DionexTcc?
100型柱温箱（美国戴安公司）;ThermoD?
37520型高速冷冻离心机（德国
Heraeus公司）;pHS?
25型pH计（上海精密科学仪器有限公司）;GenPure超纯水系统（德国
TKA公司）;KQ?
500型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率500W,频率40
kHz）;3K超滤管（PALL公司）;BP211D电子天平（德国Sartorious）;佳美SK?
1快速混匀
器（江苏金坛市佳美仪器厂）;玻璃匀浆器。
1.2试药
3
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去甲肾上腺素（NE，批号100169?
199402）、多巴胺（DA，批号100070?
200405）、5?
羟
色胺（5?
HT，批号111656?
200401）、5?
羟基吲哚乙酸（5?
HIAA，批号140737?
200501）
均购自中国药品生物制品检定所;水为超纯水，乙腈为色谱纯（德国默克公司），其余试
剂均为分析纯。
1.3动物
SPF级SD大鼠12只，雌雄各半,体质量（18020）g，由广州中医药大学实验动物中心
提供[许可证号：
SCXK（粤）2008?
0020]。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：
LunaC18柱（Phenomenex，150mm4.60mm，5m），AlltimaC18预柱
（Alltech,7.5mm4.6mm，5流动相：
缓冲液[每1L超纯水中含乙二胺四乙酸二钠
（EDTA）37.2mg、NaH2PO431.2g、辛烷磺酸钠1g，pH值4.0]∶乙腈=87∶13，流
速：
1mLmin-1;柱温箱：
35℃;自动进样器温度：
4℃;检测电压：
350mV;进样量：
15
L。
4
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2.2溶液的制备
2.2.1蛋白沉淀工作液的制备取HCLO44.29mL，加水稀释至500mL，得到0.1
molL-1HCLO4溶液，用0.22m滤膜滤过，即得。
2.2.2混合对照品贮备液的制备精密称取NE、DA、5?
HT、5?
HIAA对照品各1000
g，用0.1molL-1HCLO4定容至2mL容量瓶中，使其质量浓度均为500gmL-1。
取
以上4种对照品溶液各500L混匀，配制成各对照品质量浓度均为125gmL-1的混合
对照品贮备液。
2.2.3缓冲液的制备取EDTA37.2mg（0.1mmolL-1）、NaH2PO431.2g（0.2molL-1）、
辛烷磺酸钠1g溶解于1L超纯水中,H3PO4调pH值至4.0。
2.2.4供试品溶液的制备取大鼠禁食12h后，断头处死,在冰台上迅速分离出大脑组
织。
将标本称质量后,锡纸包好，脑组织作为实验样品保存于-80℃冰箱中。
称取脑组
织0.2g，加入0.1molL-1HCLO4溶液1mL，冰浴匀浆。
匀浆液涡旋混匀后置4℃高
速冷冻离心机中12000rmin-1离心10min，取上清液置3K超滤管中进行二次离心，
超滤后清液作为供试品溶液。
5
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2.3系统适应性试验
精密吸取蛋白沉淀工作液、混合对照品贮备液、供试品溶液各15L，按2.1项下色
谱条件进行测定，结果见图1。
脑组织样品中的NE、DA、5?
HIAA和5?
HT得到了良
好的分离,保留时间分别为2.91、4.36、5.02和8.34min，其他杂质不干扰测定结果。
2.4线性关系考察
tips:
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浅谈硒、维生素C对高氟诱导脂质过氧化影响的研究进展
6
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【摘要】我国是世界上地方性氟中毒比较严重的国家之一,大约有1亿人口受到不同
程度的影响,因此地氟病的防治研究已引起许多研究者的关注。
近年来的一些研究表
明，硒和维生素C的摄入能影响高氟诱导的脂质过氧化。
本文就硒和维生素C对高氟
诱导脂质过氧化的影响及其作用机制进行综述，并对进一步的研究提出展望。
【关键词】硒;维生素C;高氟;脂质过氧化
（SchoolofPublicHealth,GuangdongPharmaceuticalCollege,Guangzhou,Guangdong
510310,China）Abstract:
Chinaisoneofcountriesentangledbythesevereendemicfluorosisin
theworld,withaboutonemillionpeopleaffectedindifferentdegrees;thereforeprevention
andtreatmentofendemicfluorosishascausedtheattentionofmanyresearchers.Somerecent
studieshadshownthatseleniumandvitaminCintakecouldaffectthefluoride?
inducedlipid
peroxidation.SeleniumandvitaminConlipidperoxidationinducedbyfluorideandits
mechanismwerereviewedinthispaper,andthefurtherresearchwasprospected.
Keywords:
selenium;vitaminC;highfluoride;lipidperoxidation
氟是人和动物生长发育必需的微量元素。
适宜剂量的氟对人类和动物有益，而高剂
量的氟则会产生毒性[1]。
在一些地区，由于受特定的地质、地理和气候等自然因素的
影响，使环境中含有大量的氟，导致饮水、食物中氟含量过高。
在这种特定地区生活
7
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的人和动物由于长期摄入过量的氟并在体内蓄积，会出现慢性中毒，即地方性氟中毒
（简称地氟病）。
地氟病是世界上广泛分布的一种地方病，我国是该病流行最严重的国家
之一。
据报道，除上海市、海南省外，地氟病在我国其他省、自治区、直辖市均有流
行，严重威胁着病区群众的身体健康[2]。
地氟病分为3种类型，即饮水型、燃煤污染
型和饮茶型，其中饮水型是我国地氟病中最主要的类型，它主要是由于饮水中含氟量
过高，造成人体摄氟量过多，从而导致儿童的牙齿和成人的骨骼发生病变，在临床上
分别称为氟斑牙和氟骨症[3]。
关于营养物质与氟中毒的关系一直备受人们的关注。
近年来的一些研究表明，硒和
维生素C的摄入能影响高氟诱导的脂质过氧化，对机体起到保护作用。
以下就硒和维
生素C对高氟诱导脂质过氧化的影响及其作用机制进行综述。
1硒对高氟诱导脂质过氧化影响的研究
1.1人群研究
自20世纪80年代中后期提出氟中毒存在氧化损伤后，作为具有抗氧化功能的微量
元素硒与氟的关系开始受到人们的关注[4]。
Chen等发现，高氟地区高硒水平人群与高
氟地区低硒水平人群相比，MDA含量及GSH?
Px、SOD、CAT活性的差异具有统计学
意义，表明高硒可以减弱氟的脂质氧化作用[5]。
边建朝等人发现，梁山县氟病村、非
氟病村内外环境硒水平均低于正常对照村，与2处对照村健康人群比较，氟中毒患者
8
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的血、尿氟含量升高，血中GSH?
Px、SOD降低,LPO升高,GSH?
Px/LPO、SOD/LPO降
低。
结论为梁山县氟中毒病区为低硒高氟地区;高氟使体内微量元素平衡紊乱，抗氧化
酶类受损，脂质过氧化代谢异常[6]。
同时边建朝等在梁山县外环境低硒的氟病区让74
例氟骨症患者和40例氟斑牙患者口服亚硒酸钠，结果发现，服硒组和对照组相比，尿
氟排泄量增加，尿氟下降，血GSH?
Px增加，SOD活性升高，LPO浓度下降。
提示在
低硒高氟区补硒后，可提高氟中毒患者机体的抗氧化能力，减轻过氧化物对机体的损
伤，同时能拮抗体内的高氟。
1.2动物实验研究
李贤相等研究发现，加硒可增强染氟大鼠机体的抗氧化功能，提高全血GSH?
Px活
性,降低LPO含量[7]。
另一项研究表明，氟暴露大鼠的血清氟离子浓度明显升高，且
随实验期的延长而增加，饮水中同时给予一定浓度的硒则使血清氟离子浓度增高得更
为明显。
有研究用低、中、高3个剂量（0，33，770g/kg）的亚硒酸钠灌胃与低、中、高
3种浓度（0,50,100mg/L）的氟化钠饮水两两组合经口给予大白鼠5个月，发现在低硒和
高硒水平时,随饮水氟浓度的增加大鼠氟斑牙的发生率升高，体质量增长减慢;在低硒水
平时，肝、肾组织中硒含量减少而氟含量增加，股骨氟量也增加;这些变化在中硒水平
时则不明显。
还有研究采用20只大鼠，通过饮水加氟150mg/L和加硒0.5、2、4
mg/L的方法，研究氟和硒对大鼠股四头肌的组织化学活性变化的影响。
结果表明：
氟
组以及硒0.5mg/L+氟150mg/L组的LDH活性都较强，并且硒2mg/L+氟150mg/L组
的该酶活性最强,但在硒4mg/L+氟150mg/L组该酶的活性又开始下降。
9
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2维生素C对高氟诱导脂质过氧化影响的研究
2.1人群研究
地氟病的发生及严重程度与营养状况有直接的关系[8]。
维生素是人体的必需营养素
[9]。
臧增元等发现,生活水平较低的氟中毒病区居民维生素的摄入量明显低于推荐量，
氟中毒的患病率也较高[10]。
王忠霞等人为了解长期接触氟作业工人的慢性毒性及维生
素C的拮抗效果，让研究对象每日口服不同剂量（0、50、100、150和200mg）的维生
素C30d后,生化指标及各种临床症状均有所改善。
张聪格报道，氟骨症患者血浆维生
素C的含量明显低于健康者，从而影响体内胶原蛋白的合成。
田玉慧等研究发现，大
学生中不同维生素C水平其尿氟含量不同，维生素C营养充足组的尿氟显著低于维生
素C不足组;当维生素C缺乏时，维生素C水平与尿氟的排出量呈显著性负相关。
另外
也有实验表明：
补充维生素C对氟骨症病人尿氟的排泄没有影响[11]。
上官存民等为
验证维生素C治疗氟骨症的确切疗效，在陕西省宝鸡病区对316例氟骨症进行治疗后
发现：
治疗组的临床总有效率仅12.84%，与对照组比较差异无显著性;治疗组肌电图的
恢复率为20.00%，与对照组比较差异无显著性;生化及X线的检查也没有发现疗效显
著的证据;说明维生素C治疗氟骨症的临床疗效并不显著。
因此，他们对维生素C治疗
氟骨症的价值提出了质疑。
2.2动物实验
10
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20世纪50年代Vankateswarlu等发现,维生素C可使猴子的氟中毒病情减轻[12]。
在
维生素C对氟中毒大鼠不同组织抗氧化酶活性影响的研究中，将Wistar大鼠通过饮水
染氟建立氟中毒模型，并灌胃给予维生素C50mg/kg（低剂量组）、100mg/kg（中剂量
组）、150mg/kg（高剂量组）。
9月后处死大鼠，取肝、肾、脑组织测定SOD、
GSH?
Px、CAT活性和脂质过氧化物丙二醛含量。
结果发现：
低剂量组SOD和CAT的
活性显著增强，中剂量组CAT的活性反而降低，但高剂量组CAT的活性又显著升高
[13]。
氟对体外培养淋巴细胞抗氧化酶活性的影响以及维生素C的保护作用的研究发
现：
50mol/L的氟化钠可对淋巴细胞内的三种抗氧化酶有不同程度的抑制作用，10
mol/L的维生素C可不同程度地拮抗氟化钠对SOD和CAT的抑制作用，在维生素C
浓度达到40mol/L时，能拮抗氟化钠对GSH?
Px的抑制作用[14]。
在维生素C拮抗氟
致大鼠雄性生殖损害的研究中，1.0mg/mL的维生素C对雄性大鼠饮用150mg/L氟化
钠饮水所致的睾丸组织LPO含量升高、附睾三磷酸腺苷酶活性抑制等损害作用具有明
显的拮抗作用，与饮水中加入2.0mg/L亚硒酸钠的拮抗效果类似，但不能显著改善睾
丸和附睾组织中GSH?
Px的活性。
3硒、维生素C对高氟诱导脂质过氧化影响的机制研究
近年来研究者们对氟中毒的机制提出了许多假说,较公认的是自由基学说[15]。
该学
说认为:
氟是化学性质极活泼的元素,机体摄入过量氟后,氟可能直接攻击氧,干扰氧代
谢，导致氧自由基增多;氟也可能攻击构成抗氧化酶的微量元素,使抗氧化酶活性下降,同
样导致氧自由基生成过多。
自由基可攻击不饱和脂肪酸的共价键,造成脂质过氧化，导
致机体内LPO含量升高,机体生物膜因此受到损害则引发氟中毒[16，17]。
11
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硒作为人体的一种必需微量元素，其抗氧化性质已经得到证实[18]。
硒本身是一种自
由基清除剂，可以直接清除自由基和脂质过氧化自由基，从而起到保护作用[19]。
硒也
可能以GSH?
Px的方式起作用,催化H2O2分解成H2O,发挥抗氧化作用,从而保护细胞
及组织免受过氧化物的损害。
肾脏作为氟的主要排泄器官，是过量氟负荷时重要的非
骨相靶器官。
根据氟诱导自由基导致脂质过氧化发生的机制，有人曾研究硒对氟致肾
损害的拮抗作用,发现其拮抗机制之一是硒可促进尿氟的排泄。
用氟中毒动物模型证
明，加硒能提高GSH?
Px的活性,减少脂质过氧化产物,稳定细胞膜,即可拮抗氟引起的
脂质过氧化。
但是在高硒氟中毒动物模型中却表现为氟、硒的协同作用,这可能与机体
内微量元素失衡有关。
因为机体的抗氧化酶不但能协同地防止活性氧引起的损伤效应,
而且相互间起着保护作用,一旦某一过氧化物酶受到损害,可能导致整个酶活性保护系统
全线崩溃[16]。
维生素C是食物中主要的抗氧化物质[19]，是机体内一种很强的抗氧化剂。
它可直
接与氧化剂作用，以保护其他物质免受氧化损伤。
它也可还原氟化钠以及其它活性氧
化剂，这类氧化剂影响着DNA的转录，或损伤DNA、蛋白质或膜结构;维生素C还可
使双硫键（?
S?
S?
）还原为巯基，在体内与其他抗氧化剂一起清除自由基，在体内氧化防
御系统中起着重要作用[20]。
许多研究均证实维生素具有解毒作用。
当给氟中毒大鼠投
以维生素C后,维生素C可通过某种作用机制,减轻或消除氟对能量代谢的影响,促使氟
在体内代谢,加速氟的排除。
4硒、维生素C对高氟所致脂质过氧化影响研究的展望关于硒、维生素C与其他
元素联合作用对氟致脂质过氧化的影响，近年来已开始研究。
有研究发现，氟、镉可
12
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引起大鼠睾丸脂质过氧化作用增强,抗氧化酶活性降低,而硒的作用甚微。
当三者中任意
二者联合时，可降低脂质过氧化作用,三者联合时作用更强[21]。
有实验研究碘及碘硒
联用对氟致小鼠脑组织抗氧化能力下降的影响，发现适当浓度的碘或碘硒联用能使小
鼠脑内SOD活性显著升高、脂褐素含量显著下降，而碘浓度过高则产生协同毒性作用
[22]。
克里木等研究发现：
用100mg/kg的维生素C、50mg/kg的维生素E联合干预9
个月，可明显拮抗氟诱导的大鼠的脂质过氧化，显著增强大鼠肝组织内SOD、GSH?
Px
和CAT的活性[12]。
关于硒和维生素C联合作用对氟致脂质过氧化影响的研究至今还未见报道。
维生素
C和硒为地方性氟中毒抗氧化治疗的主要成分[23]，两种物质联合作用对氟致脂质过氧
化影响的研究是人们极为关注的问题，研究结果将对指导地方性氟中毒病区的日常膳
食和治疗，开展综合预防和治疗提供科学依据。
【参考文献】
tips:
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取混合对照品贮备液适量，置6个容量瓶中，分别加入0.1molL-1HCLO4稀释成不
13
[键入文字]
同质量浓度的系列混合对照品溶液，使所含各对照品的质量浓度分别为0.004、0.02、
0.1、0.5、2.5、12.5gmL-1,分别精密吸取15L进样。
以各组分的质量浓度（）为横坐标,
各组分的峰面积（A）为纵坐标进行线性回归,4种单胺类神经递质的线性关系考察结果见
表1。
表14种单胺类神经递质的线性关系考察结果
2.5精密度试验
分别配制低（0.02gmL-1）、中（0.5gmL-1）、高（2.5gmL-1）3种不同质量浓度的混合对
照品溶液,分装后贮存于-80℃冰箱内。
日内连续测5次,计算日内精密度;每份样本每日
测5次,连续测定5日,计算日间精密度，见表2。
2.6稳定性试验
取供试品溶液，分别于0、4、8、12、24h进样10L，计算各组分峰面积积分值
RSD值，分别为1.18%（NE）、3.55%（DA）、1.19%（5?
HIAA）、0.87%（5?
HT），表明供试
品溶液在4℃条件下放置24h稳定性良好。
2.7加样回收率实验
14
[键入文字]
取大鼠脑组织,经预处理后测定峰面积。
再取上述脑组织分别加入低（0.02gmL-1）、
中（0.5gmL-1）、高（2.5gmL-1）3种浓度的混合对照品溶液，按照2.2.4项下方法制备
加样回收供试品溶液，依法测定，计算回收率，结果见
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