动物细胞融合和单克隆抗体(公开课).ppt

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11、定义：

、定义：

指用自然或人工方指用自然或人工方法使两个或多个不同的细胞法使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。

融合成一个细胞的过程。

一、动物细胞融合一、动物细胞融合细胞杂交：

细胞杂交：

不同基因型的细不同基因型的细胞之间的融合就是胞之间的融合就是细胞杂交细胞杂交。

杂交细胞：

杂交细胞：

融合后形成的具融合后形成的具有原来有原来两个或多个细胞遗传两个或多个细胞遗传信息信息的的单核细胞单核细胞成为杂交细成为杂交细胞胞。

细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合受精作用受精作用二二二二.动物细胞融合动物细胞融合动物细胞融合动物细胞融合2、诱导融合的因素诱导融合的因素生物法：

生物法：

灭活的病毒灭活的病毒诱导融诱导融合合.（.（利用灭活仙台病毒是动物细利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。

胞融合所特有的。

这是由于病毒这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。

病毒外壳上的某些相似的缘故。

病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。

功能。

）化学法：

化学法：

聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG诱导融诱导融合合.物理法：

物理法：

电激电激融合融合病毒颗粒黏病毒颗粒黏附细胞表面附细胞表面细胞膜连接细胞膜连接细胞膜被细胞膜被病毒颗粒穿通病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞细胞融合、形成杂种细胞33、动物细胞融合技术的应用、动物细胞融合技术的应用细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。

远缘杂交成为可能。

利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。

利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。

思考讨论：

思考讨论：

为什么细胞融合过程中使用的为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？

不灭活行吗？

病毒需要灭活？

不灭活行吗？

因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。

活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。

总结：

比较植物体细胞杂交和动物细胞融合总结：

比较植物体细胞杂交和动物细胞融合比较项目比较项目比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合动物细胞融合动物细胞融合原原原原理理理理融合前处理融合前处理融合前处理融合前处理诱诱诱诱导导导导方方方方法法法法用用用用途途途途细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物细胞的全能性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性用纤维素酶、用纤维素酶、用纤维素酶、用纤维素酶、果胶酶去壁果胶酶去壁果胶酶去壁果胶酶去壁用胰蛋白酶用胰蛋白酶用胰蛋白酶用胰蛋白酶使细胞分散使细胞分散使细胞分散使细胞分散物理、化学方法物理、化学方法物理、化学方法物理、化学方法物理、化学、物理、化学、物理、化学、物理、化学、生物方法生物方法生物方法生物方法获得部分获得部分获得部分获得部分或完整植株或完整植株或完整植株或完整植株主要用于制备主要用于制备主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体人们获得抗体的传统方法是人们获得抗体的传统方法是?

将抗原注入动物体将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体然后从动物血清中提取抗体这种方法的缺点是什么这种方法的缺点是什么?

效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。

能产生严重的过敏反应。

运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？

运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？

能否用单个能否用单个BB淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？

产生单一类型的抗体呢？

BB淋巴细胞在体外不能无限增殖。

淋巴细胞在体外不能无限增殖。

二：

动物细胞融合的成功应用二：

动物细胞融合的成功应用二：

动物细胞融合的成功应用二：

动物细胞融合的成功应用单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备思考思考单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备极富创造性的方案极富创造性的方案将能够产生特定抗体的将能够产生特定抗体的BB淋巴细胞淋巴细胞和具有无限增殖能和具有无限增殖能力的力的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。

杂交融合在一起，形成杂交瘤细胞。

杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。

这种的特异性抗体。

这种单一类型的只针对某一特定抗原单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。

决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。

米尔斯坦米尔斯坦（阿根廷阿根廷）和科勒和科勒（德国德国）因此在因此在19841984年获诺贝年获诺贝尔奖。

尔奖。

杂交杂交杂交杂交细胞细胞细胞细胞灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞BB淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞经免疫经免疫经免疫经免疫的小鼠的小鼠的小鼠的小鼠提取提取杂交瘤杂交瘤杂交瘤杂交瘤细胞细胞细胞细胞第一次筛选第一次筛选第一次筛选第一次筛选用特定的用特定的选选择性培养基择性培养基第二次筛选第二次筛选第二次筛选第二次筛选能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞体外培养体外培养体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔提取单克隆抗体提取单克隆抗体提取单克隆抗体提取单克隆抗体1.动物特异性免疫动物特异性免疫2.分离分离B淋巴细胞（淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（）；找到骨髓瘤细胞（G）。

注意）。

注意B淋巴细淋巴细胞是一个系列。

（胞是一个系列。

（B1,B2,B3,-Bn）3.细胞融合细胞融合三种融合方式三种融合方式:

（BB;BG;GG）4.第一次筛选第一次筛选：

在：

在“选择培养基培养选择培养基培养”上培养筛选上培养筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞（只有（只有BG杂交瘤细胞存活。

但杂交瘤细胞存活。

但BG杂交瘤细胞也是一个系列：

杂交瘤细胞也是一个系列：

如如B1G,B2G-BnG。

而。

而BB,GG在此培养基上不能存活。

）在此培养基上不能存活。

）5.第二次筛选第二次筛选：

在：

在“多孔培养板上多孔培养板上”培养培养杂交瘤细胞系列杂交瘤细胞系列，每孔每孔只放一个杂交瘤细胞。

只放一个杂交瘤细胞。

“克隆化培养克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进每个杂交瘤细胞，并进行行“单一抗体检测单一抗体检测”，“检测阳性检测阳性”的孔内即是所需要的杂交的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。

瘤细胞。

6.选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养体外培养或注射到或注射到小鼠腹腔小鼠腹腔内增殖内增殖。

7.提取单克隆抗体。

提取单克隆抗体。

1、单抗的制备过程要点：

、单抗的制备过程要点：

3333）、为何要进行两次筛选？

）、为何要进行两次筛选？

）、为何要进行两次筛选？

）、为何要进行两次筛选？

44）、如何进行第）、如何进行第22次筛选？

次筛选？

培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。

培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。

第第11次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。

第次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。

第22次筛选得次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。

到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。

问题强化：

问题强化：

11）、本过程利用了哪些原理？

）、本过程利用了哪些原理？

免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理22）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与BB细胞融合？

细胞融合？

这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有不仅具有BB细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体本领，因而可以获得大量单克隆抗体1、作为诊断试剂作为诊断试剂：

在临床生化诊断、病理组织定位、在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比与常规抗体相比,具有具有准确、高效、准确、高效、简易、快速简易、快速特点特点.2、用于治疗疾病和运载药物用于治疗疾病和运载药物：

主要用于癌症治疗。

主要用于癌症治疗。

生物导弹：

生物导弹：

抗癌细胞的单克隆抗体抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素放射性同位素+化学化学药物或细胞毒素药物或细胞毒素。

（单克隆抗体：

导向。

准确找到癌细。

（单克隆抗体：

导向。

准确找到癌细胞位置，原位杀死癌细胞。

）胞位置，原位杀死癌细胞。

）22、单克隆抗体的优点：

、单克隆抗体的优点：

特异性强，灵敏度高，可大量制备。

特异性强，灵敏度高，可大量制备。

3333、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案风杆菌单克隆抗体的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？

为什么？

、该方案能达到预期效果吗？

为什么？

4、图中、图中B为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继作为诱导剂，该细胞继承承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,又能又能_。

1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_3、A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,该细胞能够产生该细胞能够产生_5、C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_培养和培养和_培养两个阶段，其培养两个阶段，其中中_代以内的的细胞属于细胞株。

代以内的的细胞属于细胞株。

制备单克隆抗体制备单克隆抗体B细胞细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代50